aide pour réaliser les PCR

[invitefeae5343]

Bonjour tous,
je fais un stage à l'étranger au cours duquel je réalise des PCR. Je comprends ce que je fais, le principe de la PCR, etc... mais il me manque tout un tas d'éléments (je pourrais demander à mon maître de stage oui, mais il parle anglais, et pour l'instant je comprends environ 1 phrase sur 6 ou 7, donc bon...). Voilà ce que je veux savoir.
Comment choisir de bon primer de telle sorte qu'ils soient bien spécifique par exemple et qu'ils s'hybrident bien sur l'amorce? (j'ai cru comprendre qu'il faut calculer un température en fonction du ratio de CG et AT, qu'il faut qu'elle soit la même pour les deux primer, truc du genre...)
Comment choisir les températures de dénéturation, d'hybrydation, de polymérisation?
Comment choisir le nombre de cycle à effectuer?
Comment choisir le temps que dure chaque étapes?
Comment améliorer la PCR, si on obtient des bandes aspécifiques par exemple, ou que on obtient que très peu de produit PCR?
merci de vos conseils

-----

[inviteaa0b1e48]

Bonjour,

Voici quelques informations pratiques concernant la PCR:

1) Choix de l'amorce
- longueur: 18 à 20 pb
- distribution balancée de G/C et A/T
- pas de complémentarité entre les extrémités des deux amorces
- Tm (T° de fusion) permettant l'annealing (hybridation) entre 55 et 65°C environ
--> formule de calcul de Tm: 4°C x (G+C) + 2°C x (A+T)

2) Dénaturation
La dénaturation initiale se fait à 94°C pendant 2 minutes environ. La dénaturation pendant le cycling se fait à la même température pendant 20 secondes.

3) Hybridation
La température d'hybridation des amorces se situe généralement 8 à 10°C en-desous de la Tm calculée. Mais il n'y a pas de règle d'or --> faire plusieurs essais à différentes températures (Tm-6,8,10°C par exemple) si obtention de bandes aspécifiques par exemple. 20 secondes sont suffisantes pour l'hybridation.

4) Elongation
La Taq polymérase (si c'est cette enzyme-là qui est utilisée) travaille idéalement à 72°C. Il faut environ 1 minute pour synthétiser un fragment de 1 kb. Pour l'extension finale, 2 minutes à 72°C.

5) Nombre de cycles
Celui-ci est variable également. On réalise généralement entre 20 et 30 cycles maximum. A ajuster en fonction des résultats obtenus.

6) Concentration des réactifs
- template (ADN matrice) : 500 ng (si DNA génomique), 1 à 10 ng (si DNA bactérien), 0,1 à 1 ng (si DNA plasmidien)
- primers : 0,1 à 0,6 µM (0,2 µM en général)
- enzymes : 0,5 à 2,5 U/50 µl
- désoxynucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 50 à 500 µM (généralement 200 µM)

7) Protocole de PCR
- dénaturation initiale
- cycling: => 20 à 30 cycles répétés
a) dénaturation
b) hybridation
c) élongation
- extension finale

Bon travail!

Cordialement.

[invitea0443c8c]

Salut!

Comment choisir de bon primer de telle sorte qu'ils soient bien spécifique par exemple et qu'ils s'hybrident bien sur l'amorce? (j'ai cru comprendre qu'il faut calculer un température en fonction du ratio de CG et AT, qu'il faut qu'elle soit la même pour les deux primer, truc du genre...)

Les primers ne s'hybrident pas sur l'amorçe : CE SONT LES AMORCES!!!!!
Non les Tm (températures de fusions des primers) ne doivent pas obligatoirement être les mêmes mais il faut qu'ils soient assez proches quand même. Pour le calcul de ta température, tu compte 2°C pour pour A et T et 4°C pour G et C. Par exemple si tu as 8 nt G et C (3G et 5C par exemple) et 11 nt A et T (8 A et 3 T) tu vas faire (8x4)+(11x2) ce qui te donne Tm = 54°C.

Comment choisir les températures de dénéturation, d'hybrydation, de polymérisation?

Engénéral on fait une dénaturation à 94°C et une polymérisation à 72°C. Pour l'hybridation ça dépend du Tm de tes primers. Tu prend le Tm le plus faible des 2 et tu enlèves 2°C (certains ne les enlève pas). Pour reprendre l'exmple de tout à l'heure : si tuas Tm1= 54°C et Tm2= 57°C tu prend 54 et tu enlèves 2 ce qui te fais 52°C....

Comment choisir le nombre de cycle à effectuer?

Classiquement on fait 30 cycles! Ne te prend pas trop la tête pour ça... Ca peut varier mais pour le moment pars sur 30 cycles.

Comment choisir le temps que dure chaque étapes?

Globalement c'est 1 minute par étape mais ça dépend pas mal de ce que tu veux amplifier. Par exemple, pour la PCR que j'ai faite il y a 4 jours j'ai mis 15 secondes pour les 2 premiers cycles et l'élongation durait 4 minutes.
Comme je ne sais pas ce que tu veux amplifier commence par 1 minute par étape et tu verras.

Comment améliorer la PCR, si on obtient des bandes aspécifiques par exemple, ou que on obtient que très peu de produit PCR?

En jouant sur tout ce que je viens de te dire mais également en faisant varier les quantités d'ADN et de primer que tu mets dans tes tubes. Si tu as mets 2µL d'ADN et que tu as très peu de produit, monte à 4µL pour voir si c'est mieux, etc.... la biologie moléculaire c'est de la cuisine

A+
Vinc

EDIT: croisement avec Fabian!

[invite56d68a15]

Pour tout ce qui est design des amorces et Tm, les logiciels calculent ça automatiquement. Y a même des sites internet où tu rentres ta séquence et tu specifies la zone à amplifier. Ils te trouvent les meilleures amorces et te donnent les statistiques (%GC, Tm, autocomplémentarité...)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefeae5343]

et bé!!!! j'en attendais pas tant!!!!! Merci bcp à vous tous!!!
Et puis pour le terme amorce, mea culpa, je voulais dire matrice...
Encore merci

[inviteba44b9ab]

Salut, voici un de ces sites internet qui selectionne des primers (comme l'a dit Jeanlain). IL marche tres bien, et est souvent cité dans des publis (a la place de logiciels payant dont je ne citerai pas le nom).
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
bonne chance, je crois que tu as toutes les info maintenant

[inviteeaf7b2be]

salut moi je voudrai placer le gene de la luciferase sous le controle d'un promoteur je voudrais savoir la methode merci d'avance

[piwi]

Là c'est du clonage, ca n'est plus de la PCR.
Il vaudrait mieux reposer la question en ouvrant un nouveau fil sinon personne n'y comprendra plus rien.


Cordialement,
piwi

[invitefeae5343]

merci cocci... j'allais justement demander...!!
quelle réactivité vous avez tous...!

[invite2d668d6f]

Bonjour,
Bonjour,
je suis en train de designer mes primers, mais quoi que je test les TM sont tres hauts (environs 80°C)
en fait ce sont des primers avec une zone qui ne se fixe pas à la matrice (zone de coupure par un ER et quelques bases en plus pour une meilleure digestion), donc j'ai en plus 15 bases qui sont complémentaires de ma matrice pour une bonne accroche. ce qui me fait un primer d'environs 30 bases
Que puis je changer pour diminuer mon TM ?
Est ce vraiment important d'avoir un TM entre 50 et 60°C ?
Merci beaucoup de votre aide

[piwi]

Bonjour,

Calculer le Tm n'a de sens qu'avec les nucléotides qui s'hybrident. Par ailleurs, le plus important est d'avoir un Tm du même ordre de grandeur pour les deux primers. La température absolue est moins importante. Ce qu'il faut comprendre c'est que plus elle sera haute plus votre Taq va se dégrader plus vite. Mais bon, même à 80C ca passe encore

piwi

[invite2d668d6f]

Merci !!
Donc, pour calculer la température d'hybridation (celle que je mettrai sur le thermocycleur (Tm -5°C)), je ne calcule le Tm que sur la base des nucléotides qui s'hybrideront ?