Aide pour PCR svp

[invite3162ba45]

Bonjour à tous j'effectue actuellement mon stage de M2 et je dois faire une pcr à partir de trois fragments d'adn différents pour n'en obtenir qu'un seul.


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Or je ny arrive pas quelles amorces choisiériez vous?


Merci d'avance
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[Jean-Luc P]

Indice : il faut que certanes amorces puissent s'hybrider à la fois avec deux des brins d'ADN.

[invite3162ba45]

Ben je sais mais cela ne fonctionne pas j'arrive à génener mon fragment central avec soit le morceau en 5' soit en 3' mais apres je n'aarive pas à rajouter le morceau manquant. J'ai un couple d'amorce à cheval entre le petit fragment en 5' et le central et a cheval entre le petit fragment en 3' et la partie centrale, j'ai un couple d'amorce aux extrémités des petits fragments et un couple d'amorce aux limites de ma partie centrale.

Et avec tout cela ca ne marche pas?

Que faire???

[Jean-Luc P]

Dans ce cas, procède en deux étapes :

fais d'abord une première PCR avec deux fragments, puis purifie ton produiit et refais une PCR avec celui-ci et le troisième fragment, avec les amorces adéquates.

Qu'en penses tu ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3162ba45]

J'ai essayé comme ça j'arrive à obtenir les deux possibilités, c'est à dire le fragment de gauche avec le central et le central avec le fragment de gauche, mais je n'arrive pas à accrocher le morceau manquant

[invitead093f97]

J'espère ne pas déranger, j'ai une question. Je sais pas si il est préférable que je crée un nouveau sujet, surtout que Francky cherche toujours une solution pour son problème, vous me direz.
Bref, ma question:
je viens de voir la technique de PCR en cours (je suis en L2 de bio). J'ai bien compris de quelle manière on arrive a amplifier un fragment. Mais si vous pouviez m'indiquer comment fonctionne dans la théorie (puisque la pratique semble poser problème) la technique dont il est question ici. Comment peut on obtenir un fragment à partir d'un seul ? J'ai du mal a "visualiser" le coup de l'amorce hybridé sur les 2 brins, et comment la pcr fonctionne de cette manière.