Compter les passages

[invite37d66f93]

Bonjour,
je travaille actuellement sur des cellules HEK. J'aimerai savoir comment sont comptabilisés les passages ? Logiquement, on devrait repartir de P0 lorsque l'on décongèle un lot mais je ne suis pas sur que cela marche comme cela - j'ai lu un travail (Luo et coll, 2005) qui parle de l'extinction de certaines protéines avec le nombre de passage. J'imagine qu'après un certain nombre de passages lorsque l'on congèle les cellules puis les décongèle un peu plus tard, ces mêmes cellules n'auront pas retrouvé leur protéines disparues - à moins que ce qui importe soit la "fatigue" des cellules ? Il ne faudrait pas dépassé un certain nombre de passage avec les HEK par exemple ??
Donc pour revenir à l'essentiel, comment compter les passages (P0 après chaque décongélation ?) et y'a t'il un nombre de passages de suite à ne pas dépasser avec les HEK ?Merci


E
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[IngDr]

En fait il s'agit de connaitre le nombre de passage depuis l'origine de la lignée.
Les congeler, ce n'est pas pour qu'elles se "reposent", mais plutôt pour se constituer un stock de cellule à un passage donné. En effet, après un certain nombre de passages, tu vas enrichir ta population en cellules mutées (mutations spontanées), qui si elles ont acquis un avantage sélectif vont devenir rapidement majoritaire. Donc si tu ne retournes jamais à un stock d'origine, ta lignée aura bien dérivé. En général, j'évite de garder les cellules en culture plus d'un mois, mais ça dépend vraiment de ta lignée, des manip que tu fais, etc...).
En ce qui concerne la perte des protéines, s'il s'agit de transfectants stables, il est possible que l'expression du transgene diminue dans le temps, soit parce que les métabolites secondaires produits par la cellule inhibent le promoteur, soit parce que les cellules inactive le transgène. Le fait de décongeler un tube de cellules congelés juste après l'établissement des clones, en refaisant une sélection à l'antibio à la décongélation permet de repartir d'une culture ou toutes les cellules expriment le transgène.

[invite37d66f93]

Bon en fait j'ai une lignée qui exprime une récepteur calcique transfecté avec un plasmide comprenant une résistance (G418) Donc à chaque passage, je dois avoir des cellules exprimant assurément le plasmide (autrement ils n'auraient pas la résistance et mourraient) et donc le récepteur en question. Seulement après 20 passages, le cellules ne sont plus activables à la caféine... (le récepteur en question libère du calcium lorsque l'on stimule à la caféine -j'observe cela en temps normal grâce à l'imagerie calcique)
Si je suis ton idée ça pourrait vouloir dire que d'autres choses ont dérivé dans la cellule ; ce qui fait que même si le récepteur (exprimé et sensible à la caféine) est présent, il lui manquerait d'autres éléments de la cellule pour être activé ?

[IngDr]

Voila les vérifications que tu peux faire après 20 passages :
- Western Blot pour ton recepteur calcique : ==> niveau protéique
- RT-PCR : ==> niveau d'ARN
- Sequencage de la séquence de ton gène et du promoteur et/ou Southern : vérifier que ton vecteur intégré n'a pas été rejeté ou qu'il ait muté.

Il est possible que malgré la présence du gène de resistance, et la sélection, tu perdes l'expression de ta protéine, si celle ci est +/- toxique pour la cellule. Seront alors selectionné (au sens Darwinien) les cellules exprimant peu ou plus cette protéine.

En résumé, même si tes cellules sont résistantes au G418, il est possible qu'elles n'expriment plus ta protéine suite à une mutation de sa séquence, ou du promoteur. Une autre hypothèse comme je l'ai dit précédement est que certains promoteurs sont sensibles aux métabolites secondaires produits durant la vie de la cellule, et qu'ils s'inhibent au fur et a mesure.

Si tu as des anticorps dirigés contre ta protéine, tu peux faire une IF pour regarder le % de cellules exprimant ta protéine au cours des passages. Cela te permettra aussi de voir la localisation de ton récepteur qui peut éventuellement varier.

Un moyen de remedier à cela serait d'utiliser un promoteur inductible. Dans ce cas ta protéine n'est exprimée qu'au moment voulu, réduisant ainsi les risques de toxicité.

Voila quelques pistes d'études à creuser si tu veux comprendre le mécanismes, mais 20 passages, ca fait 1,5 à 2 mois, ce qui est quand même pas mal. Tu risques d'avoir une dérive de ta lignée d'autant plus rapide que ta dilution de cellule est forte lors des passages (donc que le temps de doublement est rapide).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite37d66f93]

Merci pour ces pistes, je vais bûcher le différents moyens
Best
E