Neurone sans glie

[invite37d66f93]

Bonjour,
je projette de travailler sur des cultures primaires de neurones. Le problème dans cette configuration c'est que l'on se retrouve avec une population hétérogène (neurones et cellules gliales). Il existe pour cela un produit (cytarabine) utilisé en chimiothérapie qui joue sur le fait que contrairement aux cellules nerveuses, les cellules gliales se multiplient et sont sensibles à ce composé (meurent) On se retrouve donc avec des cultures neuronales "purifiées" sans glie, par contre ces mêmes neurones n'ont plus d'activité ! Est-ce que quelqu'un connaît le moyen d'obtenir des cultures uniquement de neurones sans que l'activité soit affectée ?
Merci d'avance

E
-----

[invite37d66f93]

Non vraiment, pas de solution ? J'avoue que la question est ardue mais même des pistes ou des réflexions m'aideraient. Merci
E

[invite37d66f93]

Toujours pas ?

E

[invitec7ca350e]

Bonjour,

Je sais pas si je pourrais aider avec mes maigres connaissances, mais les cellules gliales assurent le soutient métabolique des neurones, donc ça me parait logique que ces neurones ne fonctionnent plus sans cellules gliales.
Je suis pas chercheur, mais je me pencherais vers la recherche d'un milieu de culture qui apporte ce que fournissaient les cellules gliales aux neurones.
J'espère que ça peut aider mais encore une fois, j'y connais pas grand chose ...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5d91312f]

Bonjour,

Peux tu préciser le type de neurones et ce que tu comptes mesurer comme activité ?

La cytarabine marche bien mais il faut faire attention au dosage car c'est vrai que ça peut abimer la culture de neurone, mais en terme d'activité je n'ai jamais eu de trop gros problème.

Pour des neurones corticaux par exemple, je fais de la coculture pendant 72h. Ensuite je rajoute 5 à 10 µM d'Ara-C pendant 24h. Je change Le milieu entièrement le lendemain, puis le milieu est changé au 1/3 tous les 2 jours.

Si tes neurones ne répondent pas bien, vérifie qu'il ne manque rien dans ton milieu de culture (en terme d'hormone, de cofacteur).

[invite37d66f93]

En fait, il s'agit de cellules hippocampiques sur lesquelles je compte tester des doses caféine pour induire une réponse calcique (libération des stocks calciques - récepteur à la ryanodine, RyR) et observer tout cela en imagerie calcique. Il est donc possible d'après vous de maintenir ces neurones excitables même sans leurs voisines, les cellules gliales...? J'ai effectivement entendu parler de la cytarabine mais je n'ai pas de mémoire de souvenir de papiers parlant de manip sur neurone "nus" qui pourraient répondre - je vais rechercher cela, si vous avez une reference biblio je suis preneur.
Merci

[invite5d91312f]

Ah, pour de l'hippocampe ma recette est légèrement différente dans ce cas (je présume qu'il s'agit de rat ?).

J'extrais les hippocampes sur des embryons E17-E18. Je passe sur la procédure de dissociation que tu dois connaître par coeur ( si tu as un doute tu sais où me trouver ) .

J'ensemence avec du milieu avec sérum (DMEM avec 10% FBS) (pour avoir de belles cultures fonctionnelles, il vaut mieux commencer avec des gliales). Puis, quand les cellules se sont bien attachées au fond de la boite (avec le coatting) je remplace le milieu avec du neurobasal + 2% complément B27 (je rajoute 0,5 mM glutamine et 100 U/ml de penicilline et streptomycine) et je laisse incuber une semaine (tous les 2 jours je change le 1/3 du milieu).

Au final, un marquage Neurofilament et GFAP montre qu'il y a environs 97-98 % de neurones.

J'utilise ce proto pour du patch-clamp et cela marche très bien, les neurones sont bien fonctionnels. C'est un protocole assez bateau que tu peux retrouver facilement sur pubmed avec les mots clés "rat hippocampal culture".

Maintenant si tu veux vraiment avoir des neurones les plus pures possible je te recommande le proto de ce papier. Je l'ai utilisé quelques fois et ça a donné quelques résultats sympas (même si sur le plan fonctionnel je ne les trouve pas toujours terrible).



Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Ray J, Peterson DA, Schinstine M, Gage FH.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Apr 15;90(8):3602-6.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/art...bmedid=8475109


Bonne manip