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Mesure de pureté d'une préparation d'ADN aberrante?




  1. #1
    Anetheron

    Mesure de pureté d'une préparation d'ADN aberrante?

    Bonjour à tous,

    J'aimerais l'avis de quelques personnes sur une mesure de pureté au spectro d'une préparation d'ADN génomique.

    L'ADN est issu d'un broyat de foie de rat, il a été purifié par une exctraction phénolique, une précipitation dans de l'éthanol absolu et une resolubilisation dans un tampon d'élution TrisHCL 10mM + EDTA 1 mM à pH 8.

    On a fait la mesure à 260, 280 et 320 nm et on trouve respectivement 0.016, 0.001 et 0. Le tout sous contrôle de la vacataire qui n'a pas eu l'air de tiquer sur nos valeurs.

    Or si on fait le rapport 260/280 on trouve... 16. :/
    Or normalement, une valeur aux alentours de deux témoigne d'une assez bonne pureté, et une valeur inférieur à 1.8 d'une contamination en protéines. par contre je ne vois pas du tout à quoi peut bien correspondre un rapport aussi haut.

    J'avais pensé à une contamination par autre chose que des protéines, mais je vois mal ce qui a pu contaminer en absorbant à 260 pile, et ni à 280 ni à 320. Et surtout qu'est-ce qui peut contaminer mon ADN, à part des protéines? Des restes de la lyse des hépatocytes? Un truc de la solution tampon?

    Quant à la quantité estimée d'ADN, on trouve 0.8µg/mL dans la cuve du spectro, donc 80 dans l'eppendorf (dilution au centième). Ça fait environ 32 µg d'ADN purifié à partir de 100mg de foie de rat. Ça vous semble correct?

    Et enfin, encore une petite question: la mesure à 320nm ne se trouve pas dans mon cours (on y parle que de la 260 et 280). J'ai lu en cherchant sur internet que c'était pour voir s'il y avait des contaminants autres que les protéines, car ni les prots ni l'adn n'absorbent à cette longueur d'onde. Or on trouve 0, ce qui voudrait dire qu'il n'y a pas de contamination dans notre préparation. Est-ce juste?
    Et dans ce cas je comprends encore moins la valeur de notre rapport.

    Merci d'avance aux bonnes âmes qui voudront éclairer ma lanterne!
    Bonne soirée,

    -----


  2. #2
    piwi

    Re : Mesure de pureté d'une préparation d'ADN aberrante?

    Avez vous effectué plusieurs fois vos mesures? Le fait est que vous avez de faibles DO, le rapport n'est peut être pas significatif. Il suffit que votre quantité d'acide nucléique soit un peu surévaluée et que celle de vos protéines soient un peu sous évaluées et ça peut donner ça.
    Voyant vos valeur relativement faibles (vous avez repris vos ADN dans combien de µl?) on peut penser que votre culot n'était pas bien resuspendu. Du coup les prot peuvent encore être dans le fond du tube.
    L'absorbance à 320 nm vous donne la contamination avec du phénol. Ca permet de savoir si vous avez bien lavé vos échantillons après l'extraction.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  3. #3
    Anetheron

    Re : Mesure de pureté d'une préparation d'ADN aberrante?

    C'est le premier TP où on prépare nous même de l'ADN, d'habitude il nous est donné tout prêt, donc une mauvaise manipulation est plus que probable en effet.

    Le TP étant déjà à cheval sur le cours suivant de plus d'un quart d'heure, les mesures de DO de chaque groupe ont été faites à la chaîne, une fois chacun (mais sous contrôle de la vacataire).

    Les pelotes ont été reprises dans 400µL. Ce n'était pas suffisant?


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