Bonjour tout le monde,
Je dois introduire une mutation dans un gene (remplacer le TCC par un AGC) par PCR, je n'ai jamais fait une telle chose, l'un d'entre vous pourrait-il m'aider et me guider un "ti-peu" pour la procedure a suivre?
mille merci et bonne chance a vous dans vos manip,
Bodum
Salut tout le monde,
J'avais sollicite vos conseils pour une mutation par PCR, un peu avant Noel, j'avais promis de vous donner des feedback.
Alors, ben ca marche pas
J'ai tout teste, une autre enzyme, d'autres amorces, un autre protocole, mais ca marche pas.
J'ai fait 2 PCR, apres la premiere, je realise une purif sur gel, le produit est a la taille attendue.
Le hic c'est qu'a la seconde PCR, le produit attendu (780pb) ne sort pas j'obtiens uniquement et de facon recurrante un produit a 1.3 kb. J'ai regarde si mes amorces ne s'hybridaient pas ailleurs, mais non.
Alors si l'un d'entre vous a des recommendations, des idees, je suis preneuse.
Merci a tous et a bientot,
Bodum
Salut à toi,
Je viens de venir à bout d'une dizaine de clonage de ce type (mutation d'une ou deux bases) alors je peux peut-être t'aider.
Le plus simple, pour faire ces types de clonages est de faire une PCR dite divergente. En gros, tu utilises un primer qui contient la mutation voulu (à l'extrémité 5') et le reste identique au plasmide (au moins 15 bases) et un autre primer dans le sens complémentaire et qui commence à la base juste avant la mutation. Comme ça, un des primer amplifie vers la droite, l'autre vers la gauche, et tu peux de cette façon amplifier tout le plasmide. Ca fait des PCR longues (genre 6H) mais ça marche très bien.
Ensuite, tu purifies sur gel tes PCR. Tu fais une digestion avec une enzyme DpnI pendant 3h, elle permet de cliver uniquement des séquences méthylées qui ne sont présentent que dans le plasmide d'origine vu que tu n'as pas de méthylation sur le brin néosynthétisé. Cela te permet de réduire le risque d'avoir des clones avec ton plasmide wild-type.
Ensuite, tu purifie (genre kit PCR purification kit de quiagen, ou alors un phénol/chloroforme et précipitation ethanol). Tu fais une ligation de ta PCR sur elle même sur la nuit. Tu transformes et tu obtiens tes clones.
Dans mon cas, j'avais plus de 99% de clones positifs. Donc la méthode a bien fonctionné dans mon cas.
Si tu as des questions, n'hésite pas!
FX
SAlut
tu as oublier de préciser qu'il fallait phosphoryler le produit de PCR sinon il est impossible que la ligation fonctionne
A part cette technique il existe un kit qui marche tres bien sur le meme principe (presque) c'est le quickchange mutagenesis kit de chez stratagene.
YOyo
Oui tout à fait Yoyo! Un petit oubli...
Bonjour,
Je recommande fortement la technique dite de PCR assemblage !
(assembly PCR, voici la ref http://www.pubmedcentral.nih.gov/pic...3&blobtype=pdf )
C'est une technique que j'utilise très souvent et avec succès, voici le principe:
- Tu commandes 2 amorces (1 dans chaque sens) qui chevauchent la région à cloner qui contiennent les mutations à faire en leur milieu
- Tu fais 2 PCR, chacune avec une amorce de mutation + une amorce externe
- Tu obtiens 2 produits de PCR dont les extrémités 5' se chevauchent et dans lesquels la mutation est incorporée. Après contrôle et purification de ces produits, tu fais une PCR en utilisant ces produits comme matrices et seulement les amorces externes . Je conseille l'utilisation d'une polymerase proofreading.
Pour un protocole et les conditions, contacte moi par MP en joignant un maximum de données.
Bonjour,
Merci a vous tous pour vos conseils, je me mets au boulot et je vous tiens au courant.
Many thanks !
Bodum
Bonjour ,
je rédige mon mémoire et je ne sais pas dire SOEING PCR en français ( gene splicing by overlap extension)
merci par avance
Maya
