Micro ARN

[invitecc2a5091]

Bonjour à tous!

J'aimerai extraire des microARNs : il existe différents kits: Ambion, Qiagen et Invitrogen. Les avez-vous testé ? Lequel vous semble le plus adapté?
Merci de vos réponses
Amicalement
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[invite7ebb6db4]

Salut, moi j'utilise le TriZol de Invitrogen et j'en suis très satisfais (très bon rendement et toujours de très bon rapport 260/280).
Sinon tu travailles sur quoi?

[invitecc2a5091]

Salut!

Je voudrais travailler sur du tissu humain et sur du plasma humain.
J'ai déjà travaillé sur du plasma en voulant extraire l'ARNt circulant avec du Trizol invitrogen et mes rapports de DO à 280 et sutout 230 n'étaient pas fameux. J'ai même utilisé plusieurs méthodes (TRizol + KIT, TRizol + précipitation, avec des lavages supplémentaires et l'utilisation de différents carreers) c'était pas encore ça. Pourtant j'ai suivi à la lettre les protocoles usités dans la biblio.
Du coup, si j'utilise la méthode classique au TRizol je n'ai pas grand espoir rien que pour récupérer les micro ARN d'où l'utilisation de Kit spécifique en RT PCR mais d'abord en extraction.
Et toi , tu travailles sur quoi?
Merci
Amicalement

[invite7ebb6db4]

Je vois que tu as des problemes...
Voici le protocole que j'utilise pour extraire les ARN te miR d'echantillons de peau.
Apres lyse en trizol centri de 10mn à 12000rpm (pour eliminer tous dechets)
Extraction chloroforme (Attention en recuperant le surnageant a ne pas vouloir trop en recuperer au risque de contaminer ton echantillon)
Precipitation sur la nuit à -20°C en Isopropanol
2 lavages ethanol 70% glacé et non 80% avec centri 15mn 12000rpm
Puis bien faire secher le culot en eliminant toute trace eventuelle de phenol (Tres important)
Resuspendre dans 10 à 50ul d'eau (selon taille de ton culot)

Sinon moi comme je suis un peu maniaque... J'utilise toujours une nouvelle bouteille d'eau et je refais de l'ethanol... On ne sais jamais qui pipette dans ces flacon... Un peu parano... Je sais... mais sa marche.
Bonne chance.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitecc2a5091]

Salut
merci pour ton protocole. J'ai réalisé le même pour l'extraction d'ARN dans le plasma sauf que je précipitais 30 min à -80°C et non o/n à
-20°C. D'autre part, je lavais ensuite avec de l'éthanol 75° et non 70. Enfin je laissais sécher 15-30 min mais pas plus par peur de mal redissoudre le culot. Je pense refaire des essais en changeant ces petites choses. Je crois également que sur du tissu, les rendements sont meilleurs que sur du plasma.
Merci encore
Amicalement