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Déterminer la masse d'ADN dans une bande après électrophorèse



  1. #1
    Anetheron

    Déterminer la masse d'ADN dans une bande après électrophorèse

    Bonjour,

    J'ai une question sur l'exploitation d'une électrophorèse...
    Nous avons fait migrer en TP de l'ADN phagique après une PCR (un puits avec l'ADN vide, un avec de l'ADN recombiné avec un insert d'ADNc issu d'un ARNm eucaryote), sur gel d'agarose.

    On a sur le gel:

    Puits 1: une bande d'ADN vide
    Puits 2: le marqueur (http://www.fermentas.com/catalog/ele...rulers.htm#1kb, c'est le premier de la liste)
    Puits 3: une bande d'ADN recombiné

    Nous avions quelques questions à faire à la maison sur l'interprétation du gel, et l'une d'elle me bloque complètement.

    Question 6: "Calculer la masse d'ADN phagique dans le tube A à l'issue de la PCR (rappel: MM d'un nucléotide = 330Da)"

    Le tube A étant le tube dans lequel on a fait la PCR, tube dans lequel on a pipeté pour déposer dans les puits du gel.

    La prof a expliqué une fois lors du TP comment il fallait faire, puis, n'ayant pas compris, je suis retourné la voir quelques jours après pour qu'elle me réexplique et... je n'ai toujours pas compris, et la plupart de mes camarades non plus. :/
    J'aimerais que quelqu'un m'explique à sa manière comment on peut arriver à calculer ça à partir du gel s'il vous plaît.

    Sachant qu'on ne connaît pas la quantité d'ADN qu'on avait au moment de lancer la PCR, donc impossible d'appliquer juste la formule avec 2 puissance (nb de cycles).

    D'après le peu que j'ai compris à partir de ses explications, il faut utiliser l'intensité de fluorescence de la bande dans les puits 1 et 3, et la comparer à l'intensité des bandes du puits 2 (marqueur PM).

    Ensuite il y a une extrapolation à faire pour déterminer combien il y a d'ADN dans la bande de marqueur à partir de la quantité de marqueur déposée dans le puits.

    On peut alors dire combien il y a d'ADN dans la bande du puits 1 ou 3 de même intensité, et sachant quel volume on a déposé dans le puits, on peut alors savoir quelle concentration on avait dans le tube, et donc la quantité d'ADN qu'on avait à la sortie de la PCR.

    Sur le principe je ne pense pas avoir compris de travers, c'est surtout sur la determination de la quantité d'ADN dans chaque bande du marqueur qu'il y a quelque chose qui m'échappe. J'essaie de faire "logiquement" mais à chaque méthode "personnelle" je trouve un truc différent au bout.

    La question en elle-même est donc: comment faire pour déterminer la quantité d'ADn présente dans chaque bande du marqueur PM?

    -----


  2. #2
    Yoyo

    Re : Déterminer la masse d'ADN dans une bande après électrophorèse

    Salut

    on te demande la masse pas la quantité. Si tu as la taille de ta bande (genre 100nt) tu sais alors que la masse est 100x330Da. c'est tout simple.

    Pour la quantité c'est un peu plus compliqué. Tu sais la quantité d'ADN (marqueu) que tu as déposé sur ton gel (le prof a vous la donner). pour le reste ce que tu as expliqué est bon

    YOyo

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