Problème quantité d'adn plasmidique après extraction

[lashwar]

Bonjour à tous.
Je viens vous trouver car j'ai un petit doute quand à une extraction d'adn plasmidique. Habituellement j'utilise des kit qiagen (miniprep) et j'obtiens environ 100ng/µl de plasmide.
Aujourd'hui j'ai tenté de le faire sans kit (pour cause de restriction budgetaire) et en faisant un des proto donné dans un des forum (lyse alcaline) et j'obtiens plus de 2µg/µl de plasmides avec une bonne pureté (ratio spectro de 1.9) soit la même quantité qu'en utilisant une megaprep qiagen!
J'aurais voulu vos avis sur la quantité de plasmide recupére qui moi me semble enorme!! ou alors les kits qiagen sont très mauvais!
Merci pour vos avis sur la question.


PS: j'ai realisé une electrophorèse pour verifier la quantité et les formes de mon plasmide, tout à l'air ok!
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[mantOs]

Pas mal !!

Déjà que dans mon cas j'utilisais le kit promega qui donnait des resultats médiocre par rapport au qiagen, c'est surprennant

Malheuresement je ne saurais expliquer

[Yoyo]

Salut

Ca ne me semble pas surprenant, mais je pense en revanche que niveau puretée ca n'est pas la meme chose. As tu mis de la RNAse? sinon les ARN absorbent les UV!
Et puis il y a pas mal de molecules issues de la lyse bacteriennes (des sucres notamment) que tu ne purifies pas et qui vont poser des problemes lors des transfections.

Si c'est pour faire de la BM pas de soucis, si c'est pour transfecter je n'utiliserai pas cette prep.
Yoyo

[lashwar]

Eh non je n'ai pas utilisé de RNase, je me douté que ça pourrait poser problème.
Je recommence une exctraction cette après midi avec une fin de tampon de kit contenant des RNase, on va bien voir.
Sinon la prep est pour une transfection donc il faudrait qu'elle soit pure, avez vous des protocoles pour obtenir un plasmide plus pur?
Merci d'avance. et je vous tiens au courant pour la difference avec et sans RNase.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite25d591f8]

L'ARN est sûrement la source du problème! Par contre, quand tu dis que tu as effectué un gel pour vérifier les quantités et que tout était OK, est-ce que tu veux dire que tu semblais avoir du 2 µg/µl? De toute manière, c'est évidement possible. Suffit de resuspendre dans un volume assez faible.

De plus, pour transfection, j'éviterais autant que possible d'utiliser des plasmides issus d'une mini phénol-chloroforme, mais honnêtement, je n'ai jamais essayé.... Pour ma part, je préfère que l'expérience coûte un peu plus cher que de devoir la recommencer!

[Yoyo]

Eh non je n'ai pas utilisé de RNase, je me douté que ça pourrait poser problème.
Je recommence une exctraction cette après midi avec une fin de tampon de kit contenant des RNase, on va bien voir.
Sinon la prep est pour une transfection donc il faudrait qu'elle soit pure, avez vous des protocoles pour obtenir un plasmide plus pur?
Merci d'avance. et je vous tiens au courant pour la difference avec et sans RNase.

Ca ne marchera pas si tu veux transfecter tes cellules avec une miniprep phenol/chloroforme.
Si tu ne veux vraiment pas utiliser de kit (c'est quoi ton probleme avec el kit? le rendement tu peux l'augmenter par une phase d'amplification au chloramphenicol), alors il faut faire une purification sur gradient de cesium. mais c'est super chiant.

Yoyo

[lashwar]

Merci pour vos renseignements. J'ai refait une extraction en utilisant des RNases et je me retrouve avec une quantité egale à celle obtenue avec les kits.
En ce qui concerne ces derniers, le probleme ce n'est pas forcement le prix mais c'est que l'on ne peux plus rien commander jusqu'en fevrier!!!(comptes université et cnrs fermés pour bilan ou je ne sais quoi).
Bref... Les plasmides extrait sans kit c'est pour sequencé, si ils sont ok je fais de la mega ou maxi prep avec kit qiagen!
Voilà, merci pour vos reponses.

[Yoyo]

salut

ah oui je connais bien ce probleme

Sinon nous en routine on fait des exctractions phenol/chlo pour des minipreps (4ml de culture) puis sequencage. Si c'est bon on sequence le plasmide obtenu.

Yoyo