Retard sur gel

[invited5d5346b]

Bonjour ! j'ai une question sur un résultat de retard sur gel :

Je met comme sonde : un promoteur (par exemple) + protéine ( que je suspecte d'étre un facteur de transcription) :

en résultat :
si j'ai une bande : cela signifie qu'il ya un site de fixation entre mon brin d'adn et ma protéine.

si j'ai 2 bandes ( c'est la que ma question arrive) :
cela signifie bien qu'il y a 2 sites de fixation sur mon brin d'adn?
mais l'on voie 2 bandes car : la plus petite bande il n'y a qu'un site fixé par la protéine , la plus grande bande car il ya les 2 protéines fixés?

Merci d'avance pour vos réponses
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[invited5d5346b]

Hey ! personne pour m'aider ?

Je vais reposer ma question ce sera peut étre plus simple .

Je fais mon retard sur gel ainsi : je marque un oligo et j'incube avec un extrait nucléaire.

Résultat : j'ai 3 bandes , donc 3 complexes c'est bien cela?

Ce que je me demande , c'est si ces 3 bandes correspondent à 3 protéines différente sur le brin d'adn , du genre :
bande 1 : protéine A
bande 2 : protéine B
bande 3 : protéine C

Ou bien si les 3 bandes correspondent à:
bande 1 : protéine A
bande 2: protéine A+B
bande 3 : protéine A+B+C

merci d'avance

[invite6487dc7f]

Je ne suis pas un expert, loin de là, j'ai juste entendu parlé de la technique.
Mais cela m'étonne qu'il n'y ai pas de bande où la sonde est seul.
Tu as trois bande au final?
Perso si c'est possible je verrais 1 la sonde, 2 la sonde + un facteur de transcription, et 3 la sonde + le ft + une protéine couplé au FT.
Ou alors comme tu dis un autre facteur de transcription à la place de la protéines couplé au FT. Mais dans ce cas dans les deux FT il y aurait un activateur et un inhibiteur car je vois pas l'intéret de 2 activateurs ou inhibiteurs si ils se "marche dessus".

Ce ne sont que des idée, je n'ai jamais interprété de résultats d'un retard sur gel...faudra faire avec. lol

[gorben]

Salut,

Bonjour ! j'ai une question sur un résultat de retard sur gel :

Je met comme sonde : un promoteur (par exemple) + protéine ( que je suspecte d'étre un facteur de transcription) :

en résultat :
si j'ai une bande : cela signifie qu'il ya un site de fixation entre mon brin d'adn et ma protéine.

si j'ai 2 bandes ( c'est la que ma question arrive) :
cela signifie bien qu'il y a 2 sites de fixation sur mon brin d'adn?
mais l'on voie 2 bandes car : la plus petite bande il n'y a qu'un site fixé par la protéine , la plus grande bande car il ya les 2 protéines fixés?

Merci d'avance pour vos réponses

Donc une bande c'est un ADN nu.... ou pas.
2 bandes c'est un ADN nu + un ADN-proteine
3 bandes c'est un ADN nu + 2 complexes ADN-proteines (le poid de la proteine est different).

Donc en gros si tu as un systeme purifie ADN + proteine pure, tu as une bande si aucune fixation (ou fixation hyper forte et tout l'ADN est retarde), une ou deux bandes si tu as au moins un site de fixation de ta proteine. Attention, tu peux avoir plusieurs sites de fixations et seulement 2 bandes voire une seule (par exemple si l'affinite est si grande que tu ne peux voir les etats intermediaires).
En gros les retards sur gel sont assez chiant a interpreter, c'est pour ca que tu dois faire une piste d'ADN sans proteine, et differentes concentration de ta proteine. Sinon tu ne peux pas conclure grand chose.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited5d5346b]

Merci beaucoup ! c'est super sympa !

Donc en fait quand je disais j'ai 2 bandes , c'était en fait 3 , je ne parlais pas de l'adn nue!

Donc pour verifier que j'ai bien compris :
si je met adn+ protéine pure :
si j'ai 2 bandes : -adn nue
-adn + protéines

si j'ai 3 bandes :-adn nue
-adn + protéines
-adn + protéines :
en fait ici j'ai 2 sites de fixation sur l'adn c'est cela? la méme protéine peux donc se fixer sur 2 sites différent sur l'adn ( à méme ou différente affinité bien sur).
ça il me semble avoir bien compris maintenant.

Maintenant dans une situation adn + extrait de protéines cellulaire:

2 bandes : adn nue
and + protéine

3 bandes: adn nue
adn + 2 complexes !

donc ici mes 2 complexes que sont t'ils?
le premier c'est adn + protéine A ou bien adn+ complexe protéique A

de méme pour le 2 éme complexe , si la bande à un poids moléculaires plus élevé , est ce que c'est car le complexe protéique B est plus lourd ou bien que sur cette bande il ya aussi le complexe protéique A attaché?

j'espére que c'est pas trop confu.
merci !

[invitefd2d2459]

avoir trois bandes en plus de la sonde libre dans une expérience de gel retard conduit à deux hypothèses:
1) plusieurs sites de fixation sur le même ADN (par exemple un site de forte affinité et des sites plus faible)
2) la protéine utilisé s'oligomérise
Pour trancher entre les deux généralement il suffit de dimininuer la taille de la sonde