Transfection siRNA et plasmide

[invite3cfad95d]

Bonjour à tous !

Je suis doctorant en biochimie dans le domaine de la cancérologie et j'étudie l'influence d'une protéine de choc thermique (HSP) sur l'expression d'un facteur de transcription (TF).

Actuellement, je bloque sur une manip de sous-expression de HSP par siRNA dans une lignée cancéreuse, car le TF a une demi-vie extrêmement courte. Il est stabilisé par culture en milieu hypoxique (nécessitant une chambre spéciale non dispo dans mon labo) ou par traitement par des agents chimiques.

Mon problème est le suivant : la transfection du siRNA anti HSP est ok dans mes cellules, mais mon traitement pour stabiliser TF déraille et fait que je ne peux observer une modulation de l'expression de TF suite au knock-down de HSP...

Voici ma question : est-il envisageable pour une même manip de transfecter un plasmide pour une protéine (TF dans mon cas) et un siRNA pour en éteindre une autre (HSP) ?

Si tel est le cas, j'ai eu discussion avec des collègues sur la meilleure marche à suivre. Quelle serait la meilleure procédure ? D'abord introduire le siRNA, puis le plasmide (sachant que mon siRNA produit un effet jusqu'à environ 72h, et qu'un plasmide en général produit un pic d'expression entre 24 et 48h) ? Ou bien tout balancer dans la même session ?

Qu'en pensez vous ?

Merci d'avance pour vos réponses !
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[invite71f23525]

Bonjour,

Perso, moi je serais plutôt pour le siRNA d'abord, le lendemain transfection du plasmide, et le surlendemain récupération de ton TF, soit environ 48 heures de knock-down et 24 heures d'expression, ça me semble être le mieux, enfin l'expérience parlera par elle-même.

Par contre, vous supposez que HSP régule l'expression du TF au niveau post-traductionnel, bien entendu? Dans ce cas là, pourquoi ne faites vous pas un marquage à la méthionine S35 puis immunoprécipitation anti-TF et regarder à plusieurs temps la quantité de radioactivité par autoradiographie? Ainsi vous avez accès à la demi-vie de votre protéine, modulée ou pas par HSP, et dans ce cas, que la demi-vie soit courte ou pas, vous saurez forcément comment évolue l'expression de la protéine (au niveau post-traductionnel). Après évidemment, il faut faire un travail conséquent d'optimisation cinétique...

Enfin ce n'est qu'une proposition, il y a peut-être beaucoup de failles à ce que j'ai proposé car je n'ai jamais utilisé cette méthode.

Greg

PS : J'ai une bonne idée du facteur de transcription sur lequel tu bosses

[invitea0443c8c]

Bonjour!
Comme LXR:
J0 : platting des cellules avec siRNA (j'utilise l'hiperfect)
J1 : transfection du DNA (je fais jusqu'à deux plasmides, en Jet PEI) sans changer le milieu (sauf si tu transfectes tes plasmides en lipofectamine).
J2 : lyse des cellules qui auront eu 48h de siRNA et 24h de plasmides

V.