bandes en PCR et pas de bandes en southern

[invitef2e1937c]

On a effectué une extraction d'ADN plasmidique contenantle gène de la gFP qu'on souhaitait ampifier par PCR!
Sur le gel d'éectrohorèse réalisé aprés l'étape de PCR, on observe la bande à 255pb correspondant au gène gFP! cela veut dc dire que l'extraction a bienmarché et que le gène a bien été amplifié! jusque là tout va bien !!! aprés on a effctué un transfert selon southern et là rien !! y avit plus aucune bande!!!! comment se fait-l qu'on obtienne des bandes aprés PCR et qu'après southern plus rien, pas d'hybridation alors que le gène est bien présent???

Est ce que l'ADN plasmidique en solution (non intégré à des bactéries) peut rester intact à 4°C?
peut être que l'ADN plamisdique était présent en soluton los de la PCR et qu'il a été dégradé pour le southern? est ce que c'est possible ca ?

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[invitee863e61a]

On a effectué une extraction d'ADN plasmidique contenantle gène de la gFP qu'on souhaitait ampifier par PCR!
Sur le gel d'éectrohorèse réalisé aprés l'étape de PCR, on observe la bande à 255pb correspondant au gène gFP! cela veut dc dire que l'extraction a bienmarché et que le gène a bien été amplifié! jusque là tout va bien !!! aprés on a effctué un transfert selon southern et là rien !! y avit plus aucune bande!!!! comment se fait-l qu'on obtienne des bandes aprés PCR et qu'après southern plus rien, pas d'hybridation alors que le gène est bien présent???

Est ce que l'ADN plasmidique en solution (non intégré à des bactéries) peut rester intact à 4°C?
peut être que l'ADN plamisdique était présent en soluton los de la PCR et qu'il a été dégradé pour le southern? est ce que c'est possible ca ?

Il y a t-i-il un témoin positif, permettant d'affirmer que le Southern a été fait correctement ?
Sinon il est possible que le gène que vous amplifier soit muté dans la région où doit s'hybrider la zone.

[invitef2e1937c]

Oui il y a eu un témoin positif qui nous a indiqué que le southern a bien fonctionné. de plus, ca a marché sur la boite de la prof dc jpense pas que ce soit du a une mutation. on a pensé que ce peut étre la transformation ne s'est pas effectué et que ce qu'on avait en solution c'était que des bacétries non transformées. comme on a effectué la pcr le lendemain de l'extraction il y avai peu étre le plasmide en solution. mais pour le southern, il a été réalisé une semaine apré donc le plasmide a été dégradé dc pas de bandes!!!
plausible ou pas ?

[invitef0362c6c]

Je ne vois pas comment un plasmide aurait pu disparaitre en 1 semaine. J'ai déjà travaillé sur une expérience similaire où je retirais l'insert de GFP du plasmide pBlueScript (avec EcoRI) pour l'insérer dans pUC18 et je te dirais qu'après 1 mois mes plasmides étaient toujours présents. Je me rapelle toutefois d'un problème qui s'était passé. Lorsque j'ai voulu exprimer le gène de la GFP (sous contrôle du promoteur Lac) il n'y avait pas expression. Pourtant en PCR j'avais ma bande a 750pb. Après l'avoir fait séquencer nous avions remarquer que toute la partie en amont n'était pas celle attendue.

Un docteur qui était avec nous avait eu des problèmes similaires quelques années avant et figure-toi qu'il avait prit tout près d'un an pour comprendre ce qui s'était passé. Il a suggérer que l'insert pouvait avoir "déranger" la bactérie et qu'une mutation possible aurait pu la "favoriser".... À la vitesse dont se divise ces petites choses, il en a pas fallu plus pour que notre insert intact ait été dilué.

[A voir en vidéo sur Futura]