Primers

[invite6cf32659]

Bonjour

Alors voilà ma situation

Je travaille sur un organisme de micromammifères, et je veux séquencer une partie de leur cytb sur le mtDNA.

Je me base sur une publication, qui donne 4 primers (2 forward et 2 reverse, donnés en 5'-3') pour séquencer 385bp sur les 1041 que compte le cytb de cette espèce.

Avant de passer commande je veux vérifier ces primers pour être sur de leur qualité. Je précise que l'espèce sur laquelle je travaille contient 2 lignées majeures.

J'ai donc pris sur GenBank 2 séquence du cytb entièrement séquencées, ainsi que 2 séquence du cytb, séquencé pour 385 bp. (pour cette espèces )Jusque là tout va bien. Ma question est la suivante. Afin de vérifier si ces primers sont adaptés à cette partie du cytb, que dois-je faire ?

Mon hypothèse est la suivante, pour chaque primers forward, je prends son "mirroir" AAATTTGGG devient TTTAAACCC. Tandis que pour chaque reverse, je prends son "mirroir" inversé, AAATTTGGG devenant CCCAAATTT.

Suis-je dans le bon ? Merci

Et question subsidiaire, un primer doit d'accorder sur cmb de bp pour être considérer comme efficace ?
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[invite772cf17c]

salut. idéalement, ca serait cool que tes primer s'hybrident à 100%... ils font combien de pb ?

Ton problème à la base, c'est quoi ? tu veux déterminer la séquence pour voir si elle est différente de la séquence 'normale' moyenne de l'espèce ?

Pour trouver si tes primer d'hybrident bien comme il faut, il faut chercher :
- pour le primer F : 5'AAATTTGGG3' reste comme ca : ce primer s'hybride sur le brin non codant en face, donc il doit avoir la séquence du brin codant dans le même sens... il me semble en tout cas !
- pour le primer R : si ton primer R est 5'AAATTTGGG3', tu dois chercher le 'miroir inversé' 5'CCCAAATTT3', car ce primer s'hybride sur le brin codant. C'est ce que tu disais dans ton message.

De toute facon, pour ces histoires de primer, il vaut mieux sacrifier 2 ou 3 feuilles de brouillon à tête reposée plutôt que de se creuser la cervelle, des fois !

[invite6cf32659]

Merci beaucoup je vais foncer sur ClustalX