Primers pour PCR et PCRq

[invite08d5b830]

Bonjour,
je me demande si les amorces de PCR dite classique, marchent aussi pour les PCR quantitative (chimie Sybr Green).
Avez-vous la réponse, et pouvez vous l'expliquer ?
Je cherche actuellement des amorces pour certains gènes inflammatoires chez le mouton, et je ne trouve certains gènes uniquement dans des articles d'il y a plus de 10 ans. ex : GM-CSF.

Quelle est la différence entre une amorce pour le sybr green et une amorce Taqman ?

Merci pour votre aide.
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[piwi]

Bonjour.

Je vous renvoie à la pièce jointe qui se trouve dans le dernier message de la discussion suivante:
http://forums.futura-sciences.com/bi...ml#post2127166

Vous y trouverez vos réponses.

Cordialement,
piwi

[invite08d5b830]

Merci pour le pdf, très bien fait.
Cependant, je n'ai pas encore compris si les séquences d'une amorce sybr green et taqman peuvent etre identiques. N'y a-t'il pas des contraintes de tailles pour chaque type ?

je n'ai pas pu non plus confirmé mon doute a savoir si les amorces de pcr classique fonctionnent aussi pour la pcr temps réel.
Merci.

[piwi]

Les amorces dites taqman sont les hybrides couplées aux fluorchromes. La PCR en taqman nécessite par ailleurs deux autres oligos, pour amplifier le fragment, qui peuvent être les mêmes qu'en sybrgreen.

Pour ce qui est des oligos PCR, vous devez bien comprendre (je suis désolé, le pdf seul est moins parlant que le cours) que vous êtes tenu à une certaine efficacité d'amplification si vous souhaitez quantifier. Une manière d'atteindre ceci est d'amplifier de petits fragments (<250pb) où vous pouvez être confiant dans la processivité de votre TAQ.
De plus si vous souhaitez vous affranchir d'une possible contamination génomique il vous faut prendre deux oligos séparés par au moins un intron.
Si les oligos dont vous disposez remplissent ces conditions, vous pouvez faire un essai pour voir si l'efficacité de la réaction est satisfaisante.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

je n'ai pas pu non plus confirmé mon doute a savoir si les amorces de pcr classique fonctionnent aussi pour la pcr temps réel.

Oui mais il faut dans la mesure du possible prendre des primer de type "exon-exon" qui vont encadrer un intron de grande taille. Dans le cas où des ADNg contaminent vos preps de mRNA, le fait d'avoir un primer sur un exon et l'autre sur l'exon suivant va permettre de sélectionner les mRNA et d'éliminer les ADNg dans la mesure où l'intron de grande taille fera "planter" la PCR : seuls les mRNA seront amplifiés.

V.