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Quantité d'ARN pour PCRq



  1. #1
    malesore

    Quantité d'ARN pour PCRq


    ------

    BOnjour à tous,


    J'ai encore une petite question pour la PCRq.

    J'aurais aimé savoir quel est la quantité requise en ARN pour faire de la PCRq. J'imagine que ca dépend de la sensibilité de la machine, mais c'est juste pour avoir un ordre d'idée car comme je fais la microextraction savoir si je suis vraiment loin du compte ou si ma microextraction suffit et évitera de "pooler" des échantillons.


    Merci pour votre aide


    A plus

    -----
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

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  3. #2
    IngDr

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    Dans ton cas, je pense que tu feras de la RT PCR one step ?
    Sinon, si tu fais de la RT PCT en 2 étapes, une RT sur 3 ug te permet de faire au minimum 50 qPCR.
    Sur un lightcycler 20ng-50 suffisent largement. Mais je pense qu'il y a moyen de descendre encore en dessous.
    Ce qui est important dans ce cas, c'est la qualité des amorces, qui ne doivent pas faire de dimère de primers en présence de trop faible quantité de matrice.

  4. #3
    Marie_Eve

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    Hello
    Dans mon labo je fais de la RT-PCRq à partir de cellules souches hématopoïétiques de souris après un tri par cytométrie. Le plus petit que j'ai fait pour le moment : extraction d'ARN et RT sur 400 cellules puis séparation en 4 puits de PCRq soit l'ARN de 100 cellules environ par puit et ca marche au poil !
    Bonne continuation

  5. #4
    malesore

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    Merci pour vos réponses,

    Moi avec le kit de micro extraction, j'obtiens des rendenements de 10 ng/ul, vous pensez que ca devrait le faire ?

    Sinon je poolerais mes échantillons, ca coutera moins cher en qPCR
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  6. #5
    Marie_Eve

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    Ca le fait très très très largement, pas d'inquiètude, l'ARN que j'extrais n'est même pas dosable au nanodrop vu la mince quantité mais en faisant une RT avec des "random hexameres" pour améliorer le rendement, les ADNc fonctionnent très bien en PCRq

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    malesore

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    Ah ben c'est parfait tout ça, ca me rassure, plus qu'à faire de bons primets et le tour est joué

    Merci encore
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

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  10. #7
    Marie_Eve

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    si tu veux être sur de ne pas être contaminé par de l'ADN, pense à choisir tes primers chacun dans un exon différent ou bien carrément l'un des primers chevauchant 2 exons

  11. #8
    malesore

    Re : Quantité d'ARN pour PCRq

    ok merci du conseil
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

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