Western blot incubation Ac I sous sachet scellé

[invite12eacae4]

Bonjour,

voilà j ai une petite question à propos de la technique de western blot et en particulier de l'étape d'incubation avec l'Ac Iaire.

Pour mes manips, j'avaas déjà fait plusieurs WB en incubant ma membrane dans une solution d'AcI, dans un bac sous agitation.

Et dernierement j ai mis ma membrane sous scellé dans un sachet, qui était assez rempli de solution, et je pense que la solution ne "bougeait" quasiment pas sur la membrane.

Et au final, j'ai obtenu un signal très fort après révélation (superieur a ce que j'obtiens d habitude), et je me demandais si celà pouvait etre a cause d'une mauvaise agitation.

Merci beaucoup !!!

Charlotte.
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[LXR]

Bonjour,

La solution de TBS-T lait avec anticorps primaire bouge rarement de façon visible dans la poche d'incubation. Pourtant à une échelle inférieure, invisible, il y a bien un mouvement suffisant pour avoir un marquage homogène. Le fait que vous ayez un signal fort provient soit d'une trop forte concentration en anticorps primaire, soit une concentration trop forte en anticorps secondaire, soit d'un temps d'exposition trop long. Si vous avez déjà réalisé des western blot sans soucis avec d'autres anticorps primaires nécessitant l'anticorps secondaire utilisé ici, cela provient certainement de la dilution de l'anticorps primaire.

Greg

[invitea9a4c686]

J'utilise cette technique aussi, je sais que je fais en sorte qu'il y ait quelques petites bulles d'air pour voir la solution bouger sur la membrane.
Bonne chance !

[IngDr]

Quelques toutes petites bulles pourquoi pas, mais il faut absolument éviter les grosses bulles qui viendraient se plaquer sur la membrane, ou rendre le contact avec le lait + Anticorps inhomogène sur la membrane.
Dans tous les cas, une grosse agitation n'est pas nécessaire si ton mélange lait + anticorps est bien homogène.

[A voir en vidéo sur Futura]