Révélation des extraits d'ADN

[botrytis]

Salut les amis,
Après être passée par l'étape de la préparation des solutions pour mon extraction (réussie grâce aux membres du forum), je me suis jetée à l'eau pour faire ma première extraction. j'ai eu au final de minuscules petits dépôts au fond de mes eppendorfs, on m'a assuré que c'était de l'ADN

Bref, la suite logique c'est bien sure la révélation sur un gel d'agarose, seulement voilà, aujourd'hui après avoir placé mon gel dans la cuve j'ai obtenu de grosses taches bleues qui ne ressemble aucunement au profil auquel je m'attendais

1-cela signifie t-il que mon extraction a échouée?
2-serait ce du à mon gel ?

Merci
-----

[piwi]

Mais vous avez mis du bleu de charge dans vos ADN non? Les bandes bleues c'est en vision directe ou après une quelconque révélation que vous n'expliquez pas?
Pourriez vous précisez un peu plus ce que vous avez fait?

Cordialement,
piwi

[botrytis]

Bonsoir Piwi,
Merci de m'avoir lue, vous répondez toujours présent à mes SOS. vous avez raison, je n'ai pas précisé le déroulement des choses. Je me corrige de suite.

1-j'ai d'abord préparé un gel d'agarose à 8%un gel dans 60ml de TBE+ 2µl de BET avant de laisser polymériser.

2-j'ai plongé le gel dans la cuve à électrophorèse qui contenait 350ml de TBE

3-parallèlement, j'ai préparer les échantillons à spoter en prélevant 7µl d'extraits d'ADN dissouts dans du TE, auxquels je rajoute 3µl de tampon de charge (Bleu de bromophénol).

4-j'ai spotté, laissé migrer à 80 volts.

les fameuses bandes bleues sont apparues après migration, et aucune fluorescence n'est apparue au transilluminateur. j'espère avoir répondue à votre questionnement

Merci

[piwi]

Vous avez préparé un gel d'agarose à 8%? vous êtes sûr de cela? Je ne suis même pas certain que cela soit possible. 0,8% me semble plus réaliste.
Maintenant les bandes bleues ne correspondent elles pas simplement au front de migration?

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

8% d'agarose?? J'espere que ce n'est pas pour migrer de l'ADN genomique...

Les bandes bleues peuvent etre le front de migration (bleu de bromophenol) si c'est aux alentours de 100-200 pb.
Tu n'as meme pas de fluorescence pour ton marqueur de PM?

A+

[botrytis]

Bonsoir les amis,

Je suis tellement confuse, bien sure que c'était du 0,8%, c'est tout nouveau pour moi, heureusement que mes pense-bête sont là.

je crois que je me suis trop précipitée avant de me poser des questions, les bandes bleues ont finalement révélées une fluorescence bien nette pour les premiers puits qui correspondaient à des ADN extraits avec un kit tout prêt.

par contre la seconde série de puits correspondait à des ADN extraits à l'ancienne avec toute l'armada de solutions que j'avais eu tant de mal à préparer.

cela veux donc dire que mon extraction old school a échouée

[gorben]

cela veux donc dire que mon extraction old school a échouée

T'inquiete pas, c'est tres facile de perdre un culot d'ADN lors de la precipitation quand on est novice

A+