Radioisotopes en biochimie

[invite39dcadc1]

Les TDs étant finis, et l'examen dans une semaine je me trouve avec cette longue exo non résolue et ça m'énerve. S'il vous plait de me aider...

Vous synthétisez une sonde ADN marquée par extension d'amorces au hasard par une ADN polymerase. Le milieu de réaction contient, netre autres, 100 ng d'ADN matrice, un mélnde de dATP, dTTP, dGTP et dCTP (dNTP) contenant 6 µl de dATP [³²P] 3000 Ci/mmole, 10µCi/µl dans un volume final de 50 µL. Pour déterminer l'activité spécifique de la sonde synthétisée, on dilue 1 µL du milieu réctionnel au 1:100 et on dépose 5 µL de cette dilution sur deux filtres dont un sera lavé pour éliminer les dNTP non-incorporées et l'autre pas. Sur le filtre lavé on compte 14.91 * 10 ⁴ cpm et 18.12 * 10 ⁴ cpm pour l'autre. Quelle est la fraction de radioactivité incorporée? En considérant que les 4DNTPs ont la même fréquence dans la sonde, quelle sera la quantité d'ADN synthétisée (en ng) si toute la radioactivité est incorporée? Quelle est la quantité d'ADN réellement synthétisée? Quelle est l'activité spécifique de la sonde (en cpm/µg)????



J'ai commencé par trouver le nombre de moles radioactifs(de dATP) dans le mélange (par la RAS) et je trouve 2*10 ^-5 mol. Tout ça dans un mélange de 50 µL. A partir de ce milieu réactionnel une sonde d'ADN va se synthétiser. A partir d'un volume de 1µL, on forme une solution diluée(1/100)=>Volume=100µL.

J'ai transformé le cpm en Ci et pour le premier filtre je trouve 676.1*10^-10Ci et pour le duexième 816.2*10 ^-10Ci.
Mais quand j'y repense j'ai pas besoin de nombre de moles que j'ai calculé au début..mais ça serait la quantité(la masse) de dATP marqué puisqu'ils me demandent la RAS en cpm/µg?

Je suis embêtée..Une idée...???
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[invite39dcadc1]

Si personne ne peut me répondre à la première question, je vous invite à une deuxième exercice, qui est relativement plus facile sauf que je bloque à la deuxième question.

La polynucléotide kinase catalyse le transfert d'un groupement phosphoryle de l'ATP sur l'extrémité 5' de moléculed d'ADN:en utilisant de l'ATP [³²P], elle permet de marquer sélectivement les extrémités C'est une réaction très utilisée pour marquer des fragments d'ADN de synthèse (oligonucléotides).
Les conditions de réaction sont:

1µl oligonucléotide à 10pmoles/µl
2µl tampon
11 µl H₂O
5µl ATP [³²P] (5000 Ci/mmole et 10 mCi/ml)
1 µl polynucléotide kinase
incubation 45 minutes à 37°C

1.Quelle est la concentration en ATP de la solution utilisée et celle dans la réaction de marquage?
2.Si dans les conditions que vous utilisez, 50% de la quantité de radioactivité ajoutée est transférée sur l'oligonucléotide,quelle sera l radioactivité spécifique(en Ci/mmole) de cet oligonucléotide? Quelle sera la proportion de molécules d'oligonucléotides marquées? Comment essaieriez-vous de l'augmenter (avec les mêmes réactifs)? Quelle serait ici la radioactivité spécifique?
3.Vous n'utilisez cet oligonucléotide marqué que 9 jours plus tard, quelle esta lors sa radioactivit spécifique? (t de demie-vie=14.3jours) 1Ci=3.7*10¹⁰Bq




Le nombre de moles de nucléotide est 10 pmoles.
Les concentrations de l'ATP sont facilement trouvables.
Mais pour la deuxième question, si dans le flacon de 5 µl on a une RAS, on a:
10 mCi/ml = 10 µCi/ µl ==>pour 5 µl, RAS= 50 µCi/µl
5000 Ci/ mmole = 5 * 10⁶ Ci/ mole
donc 5 * 10⁶ Ci/ mole=50 µCi/µl
==>dans les 5µl marqué, le nombre de moles est 10 pmoles.
Donc, si la moitié de cette quantité est utilisée pour marquer l'oligonucléotide, alors seulement 50 % de l'oligonucléotide seront marquées.
C'est bien ça?