Temps de migration de long fragments d'ADN

[inviteb1bc3ff4]

Bonjour
J'ai une petite question de protocole d'électrophorèse.
Je cherche à estimer le nombre et la taille des plasmides de différentes souches de Salmonelles, par electrophorèse après restriction .
En faisant un peu de biblio sur les marqueurs que j'ai allumé en PCR, j'ai vu que je pouvais m'attendre à des fragments allant jusqu'à quelques kpb voire dizaines de kpb (max 50-60).
Par contre, les protocoles d'électro ne sont jamais complètement explicités, et comme c'est la première fois que je vais faire migrer des fragments aussi gros, j'ai besoin d'un peu d'aide.
Comme marqueur de taille, j'ai une échelle de PM jusqu'à 10kb, et des souches de réf avec plasmides de taille connue dans mon frigo.
Suivant les articles, gel à 0,7 ou 1% d'agarose, voltage 100V.
Par contre rien au niveau du temps !
Avez vous une idée, au moins pour l'estimer ?
Je pense pas pouvoir m'aider de la migration du bleu, il me semble avoir lu quelque part qu'il se comportait comme un fragment de 300 à 1000 pb.
Merci à celui qui pourra m'aider !
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[gorben]

Salut,

Dans mon ancien labo ils faisaient migrer des plasmides de salmonella apres digestion... Ils le faisaient en PFGE.
Des fragments de 50 kb en electrophorese normale ca me semble trop gros, tu n'arriveras pas a quelque chose de joli.

A+

[piwi]

Bonjour,

Pour les grands fragments il faut passer par une électrophorèse en champ pulsé pour les séparer convenablement dans un gel d'agarose. Pour le gel il me semble évident qu'il faut prendre le moins concentré, 0,5-0,6%. Le temps de migration c'est au feeling. Vous faites migrer une ou deux heures, vous regardez sous UV, si ce n'est pas bon, vous refaites migrer etc...

Cordialement,
piwi

[inviteb1bc3ff4]

Malheureusement pas de champ pulsé dans mon (petit) labo !
On va essayer donc comme ça "au feeling", si vraiment trop moche on essaiera de trouver une PFGE à "squatter".
Merci à tous les 2 !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefeecbae9]

Je sais que ma reponse vient un peu tard par rapport a ta question mais si tu veux pour l avenir j'ai une astuce :
tu peux faire une electrophorese normale avec un gel 0.3prcent grand format a 30V pendant 14-16h, et tu obtiendras un beau gel avec une belle separation. En ce qui concerne les marqueurs tu peux aussi utiliser de l'ADN de Lambda clive avec Xho1 tu obtiendras trois jolies bandes : 15.5kb, 33kb et le Lamba non clive a donc 48.5kb. Juste fais tres attention dans la manipulation du gel , n hesite pas a le faire un peu plus epais que d habitude....
Voila

[piwi]

Un gel 0.3%? C'est possible ça?

Cordialement,
piwi

[invitefeecbae9]

Oui Oui!
Peut etre difficile a croire mais j en fais assez souvent. Et ca se manipule, delicatement, mais ca se fait. Et honnetement ca fait de jolis gels...

[piwi]

Je ne remets pas en doute votre parole. C'est simplement qu'il me semblait qu'en dessous de 0.5%, les gels étaient imanipulables. Vous faites des gels de 2cm d'epaisseur?

[invitefeecbae9]

Non meme pas .Je sais pas pour un gel de 15x15 je mets 150ml de TAE + 0.3prcent agarose, je dirais de l' ordre du demi centimetre au maximum. C'est sur que le gel est souple comme une feuille, mais en faisant attention ca va. J'en ai brise qu'un seul et c'etait parce que j'etais presse...Et une fois le gel sans son "moule" plastique alors il est clair qu'il est difficile de le recuperer entier bien que je n'ai pas essaye. Mais ca reste plus pratique de faire ce gel a 0.3prcent qu'une PFGE surtout si on en a pas a disposition.

[invitefeecbae9]

Petite astuce : en fait il est possible de couler une fine couche qui servira de support a 1p.c et ensuite par dessus couler le gel 0.3p.c. Et la je garantis une maniabilite parfaite!!

[piwi]

Ah oui! Ca c'est pas bête du tout comme astuce. Merci pour l'idée.

Cordialement,
piwi

[invitefeecbae9]

Avec plaisir....