Protéine non détéctable
Bonjour à tous,
Voila, j'ai réalisée une construction dans le pCS2 flag, la construction a été vérifiée par séquencage sans aucun soucis. Par contre pas moyen d'avoir la protéine en western blot, j'ai donc réalisé une autre construction qui exprime ma protéine d'intérêt fusionnée à la GFP même chose rien!!!!
C'est une construction qui m'est indispensable pour la suite de ma thèse. Alors si quelqu'un à une petite idée cela m'arrangerai bien.
Merci d'avance
salut
tu pourrais nous dire dans quel systeme tu travailles et quel est l'origine du gene que tu clones?
YOyo
salut,
enfait j'ai cloné un gène d'environ 600 pb exprimé chez le xénope dans le pCS2 flag. le clonage marche super bien et tout. la séquence de mon gène est bien en phase avec mon étiquette en 5', ya pas de mutation rien. tout devrait bien marché mais voila j'ai pas de proteine. je synthètise in vitro mon ARNm qui contient une cap en 5' et le polyA en 3' donc qui est suposé etre stable, j'ai une belle bande. puis je microinjecte mon ARNm chez l'embryon de xénope pour faire des WB et la j'ai rien pas de bande protéique ( ce n'ai pas un problème de gel de migration car il est à 15%).
merci beaucoup pour votre aide
Quand vous dites que vous n'avez pas de protéine GFP-prot c'est parce que vous ne parvenez pas à détecter la GFP in vivo ou parce qu'un WB ne donne rien?
Il faut essayer de faire passer votre construction dans un autre vecteur. Vous avez moins de 1000 pb à sous cloner, ça devrait être simple. C'est l'histoire de trois jours. Dans le cas où vous ne parviendriez toujours pas à détecter un signal GFP, j'aurais tendance à essayer en culture cellulaire le FLAG et la GFP. Si vous voyez la GFP vous pourrez faire une ICC pour aller faire votre WB@FLAG pour vous assurer que votre protéine est bien produite. Dans ce cas là, c'est un problème biologique. La protéine que vous injectez dans vos oeufs doit elle se trouver là en temps normal?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Merci pour votre réponse PIWI,
Enfait ma protéine est exprimée de manière ubiquitaire chez l'embryon de xénope donc elle ne doit pas être dégradée!!!! Je vais essayer de mettre ma protéine dans un autre vecteur la semaine prochaine et voir d'abord en transcription traduction in vitro si elle est exprimée ou pas avant de basculer vers les surexpressions.
Bon j'espère que ça va marché
bien à vous
