Bonjour,
je dois déterminer le pH et la température optimaux de mon enzyme et je voudrais comprendre la différence entre la détermination du pH optimal et la stabilité de l'enzyme à différent pH (de même pour la température).
je ne trouve pas de protocole expérimental bien détaillé me permettant de comprendre comment je pourrais faire.
Merci d'avance pour votre aide.
Bonjour et bienvenue sur FSG,
La température ou pH optimal de l'enzyme pour la catalyse va pouvoir être définie en mesurant les paramètres de cinétique enzymatique (Km, Vm, Kd,...), grâce à des expériences de mesure de vitesse initiale.
Pour ce qui est de la stabilité de l'enzyme à différents pH/température, je pense que plusieurs paramètres peuvent être mesurés comme l'association d'un substrat radiomarqué à l'enzyme, son intégrité multimérique s'il s'agit d'une enzyme nécessitant l'association de sous-unités. Dans ce dernier cas l'enzyme peut être placée dans les conditions voulues puis on peut la faire migrer en condition non dénaturantes afin d'observer la migration d'un dimère, trimère, tétramère ou plus (enzyme sous forme stable ou plus ou moins stable) ou la migration d'un monomère (enzyme instable). Ce ne sont que des propositions, d'autres techniques peuvent être employées (ionisation douce en ESI-MS, RMN, digestion ménagée,....). Le but de ces approches étant d'observer une modification de la structure de la protéine qui en soit est témoin d'une déstabilisation de la protéine.
Greg
Salut Greg,
je te remercie énormément d'avoir répondu à mes questions et j'en ai d'autres. C'est que la biochimie n'est pas vraiment mon domaine et j'ai parfois des petits casse-têtes. Pour déterminer le pH optimal de mon enzyme, faut-il incuber l'enzyme et le substrat à un pH donné pendant un certain temps et effectuer le dosage... ou incuber l'enzyme seul au pH désiré pendant une certaine période puis, ajouter le substrat par la suite et effectuer immédiatement le dosage.
merci encore,
Aya
Alors il faut placer le tampon du milieu réactionnel au pH voulu, mettre le substrat puis l'enzyme. Il faut mesurer la DO (densité optique) avant de mettre l'enzyme (t=0) puis mesurer la variation de la DO à des intervalles de temps réguliers. Ainsi on a une courbe DO = f(t) qui permettra de calculer une pente sur la première partie de la courbe (vitesse initiale). Mais pour cela il faut bien entendu avoir un substrat et/ou un produit qui absorbe dans le visible.
Greg
Merci beaucoup, il ne me reste plus qu'à manipuler en espérant trouver de bons résultats. En fait, je dose les groupements reducteurs des acides galacturoniques formés par la dégradation du pectate sous l'effet de l'enzyme. Le dosage de l'activité enzymatique s'effectue au DNS (methode de Miller). Je pense que ça devrait aller.
Aya
