Problème expérimental de mort de cellules

[invitec09f3de6]

Bonjour,
Mon stage de M1 de physique consiste à envoyer un flux (du milieu CO2 indépendant) sur des agrégats de cellules pour observer leur déformation. Les agrégats sont disposés dans un capillaire en verre, préalablement traité à la fibronectine pour faire adhérer les agrégats.
Cependant, jusqu'à maintenant, les agrégats se font toujours arracher, au bout de huit heures environ, ce qui m'empêche d'observer leur déformation, alors que c'est l'objet de mon stage...
Je pense que c'est parce que les cellules meurent (les agrégats se rétractent un peu sur eux-mêmes dans les instants qui précèdent l'arrachement).
J'ai beau chauffer à 37°C et renouveler le milieu en cours d'expérience, rien n'y fait...
Je ne suis pas biologiste, donc peut-être que quelque chose d'évident m'a échappé... Merci d'avance pour vos réponses, qui me permettront peut-être de faire un grand pas dans mon stage !
-----

[invite07f30d6a]

en gros si j´ai bien compris, tu place tes cellule en soufflerie....
comment tu fait pour souffler le CO2 sur les cellules et en meme temps leur fournir du milieu (j´ai du mal a vusualiser)
le milieux est il adapte aux type cellulaire?
on te fait bosser sur des cellules alors que tu est physicien... y a pas quelqu´un qui est cense ce charger du cote biologie?
peut etre augmenter le temps d´incubation avant le flux....
d´autres idees plus tard

[invitec09f3de6]

Merci pour ta réponse.
En fait, j'ai peu d'interaction avec les biologistes, et pour l'instant, ils n'ont pas su me répondre pour ce que j'ai pu leur en parler.
Et je ne travaille pas en soufflerie, je n'envoie pas du CO2 sur les cellules : c'est un flux liquide de milieu que j'envoie (le capillaire qui contient les agrégats est relié à des tubes eux-mêmes reliés à une pompe, qui permet de faire circuler le liquide).
C'est juste que j'utilise du milieu "CO2 indépendant", parce que j'effectue la manip' en salle normale, et non en incubateur. Normalement, c'est bien ce milieu qu'il faut utiliser...
En tout cas si tu as d'autres idées, je suis preneuse !
Comme je ne suis pas biologiste, je ne connais pas les causes habituelles des morts accidentelles de cellules...
Merci d'avance.

[invite07f30d6a]

euh je vient de realiser un truc tout con,
ton milieu doit etre tamponné, avec quoi? NaHCO3 ou autre....
as tu un marqueur de pH dans ton milieu (phenol red)

si ton milieu est rouge (pH=7) dans la bouteille, quand tu le met en presence de CO2, il devient rose (pH>7)?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec09f3de6]

Le milieu CO2-indépendant que j'utilise comme flux dans cette manip' est toujours orange (contrairement au milieu rouge/rose dont tu parles, que j'utilise pour la culture cellulaire destinée à l'incubateur), et d'après les biologistes, avec ce milieu, on n'a pas besoin de se préoccuper du pH, c'est pour ça qu'il est adapté aux expériences en salle "classique".
Merci d'essayer de m'aider en tout cas, parce que là je suis bloquée... !

[invite07f30d6a]

tamponé avec du TRIS ou quelque chose comme ca,
tes biologistes ont du te donner un öilieu adapte a ton type cellulaire (bacterie, ou autre?)
est ce que tes cellules poussent quand tu les met dans ce milieu sans le flux?
avec ou sans coating Fn

demandes a tes biologiste de verifier qu´il y a bien mort de tes cellules (demande leur un live/dead assay d´un de tes aggregat arraché pour voir ca, cést rapide si ils ont des kit tout pres)
t´as essayer la meme chose avec ton milieu d´incubateur et le flux?

[invitec09f3de6]

Oui avant j'ai essayé avec du milieu de culture comme flux, et ça faisait la même chose. Je pense que le nouveau milieu est en effet adapté. Les cellules sont des cellules de souris, dont on peut contrôler le niveau de cadhérine.
Et avant j'avais fait des expériences sans flux avec Fn, et les cellules poussaient...
En ce qui concerne le test live/dead assay, en fait une fois que les agrégats sont arrachés, on ne peut pas les récupérer, donc je ne peux pas le faire...
Pendant les premières heures, l'agrégat grossit de par les divisions cellulaires, puis peu avant d'être arraché, il se recroqueville, j'ai interprété ça comme la mort des cellules.
Est-ce que sinon ça pourrait être dû au fait que la résistance que les cellules doivent opposer au flux affaiblit leur liaison avec la surface, malgré la fibronectine ? Dans ce cas, que faire ?
Merci !

[invite07f30d6a]

si c'est des lignées de cellules animales, elles ont besoin d'etre adherentes pour survivre, donc de toute facon elles mourront dans l'heure qui suit l'arrachage.
selon la surface que tu as (cm2) tes cellules peuvent former une monocouche en quelques heures, a partir de la leur activité va diminuer voir elle vont entrer en apoptose si elle ne pousse pas en multicouche (a verifier au microscope)
tu me dit que ton amat grossit, donc tes cellules pousse en multicouche
quand je sort mes cellule de leur flasque, avec de la tripsine, si j'ai trop attendu et ai une monocouche, la tripsine decolle le tapis cellulaire quasiment d'un bloc, ce qui me fqit penser a ton cas, ce qui voudrait dire que l'interaction avec la surface ne se fait plus.
les interactions entre tes cellules et ta surface devrait ce faire par l'intermediaire des integrine entre autre, ces interactions ne sont pas covalentes et du coup c'est leur nombre qui fait que la cellule adhere, si ton amat cellulaire oppose trop de resistance a ton flux, il y a de grandes chance pour qu'il se decroche.
petite question, le temps de 1/2 vie de ta fibronectine coatée sur ton verre? tu as peut etre une degradation ou un lavement de ta fibro...essayes de refaire le test du coating apres avoir fait passer ton flux 8h dessus (immunomarquage ou autre que tes biologiste se feront une joie de faire...)

le decrochage est partiel ou c'est l'ensemble qui vient? dans le 2eme cas, suspecte un flux trop imortant pour ton amat, dans le premier...aucune idées enfin si mais un comportement de bacterie en biofilm ne passe pas...

il existe des tamis cellulaires, si tu peux arriver a en pllacer un apres ton tube de verre, tu pourais recuperer les cellule, avec un kit live/dead pres t'en a pour 5minute a verifier.

la solution: ARRETES DE MALTRAITER CES PAUVRE CELLULES!!!!
arf

sinon dans ton milieu, il y a peut etre quelque chose qui entre en interaction avec ta Fn au detriment de tes cellules.
verifies quand meme que ton milieu de flux est compatible avec tes cellules
est ce que tu as essaye plusieur intensité differentes de flux?

par contre je comprend vraiment pas comment on peut balancer un physicien sur un sujet ou la survie cellulaire est primordial sans l'aider plus que ca...
le coup du "ah? ben regardes ce que tu peux faire (et demerdes toi)" je trouve ca limite

PS sorry pour les fautes de frappe, je passe d'un clavier francais a un allemand...

[invitec09f3de6]

Merci infiniment pour toute ces idées, ça m'aide beaucoup !
En effet c'est un peu étonnant qu'une physicienne soit sur ce genre de sujets, mais ce sont des physiciens qui l'ont donnée, alors ils ne se rendaient peut-être pas compte... je pense qu'ils n'avaient pas prévu ce problème de mort cellulaire, et maintenant pour le résoudre c'est vrai que je suis un peu désarçonné.
Pour répondre à tes questions, c'est tout qui s'arrache, et j'ai essayé différentes vitesses de flux sans succès.
Enfin, pourquoi dis-tu que les cellules ont besoin d'être adhérentes pour survivre ? Pour préparer les agrégats je les laisse 24h en suspension dans un mélangeur rotatif, et elles survivent...

Encore merci, maintenant je vais pouvoir me débrouiller !

[invite17a570c1]

Salut,

Tu as une expérience contrôle? Càd, une expérience où tu n'appliques pas de flux?

[invite07f30d6a]

la pluspart des cellules animales ont besoin d´un support matriciel pour survivre, mes cellules souche par exemple ont tendence a mourir si elle sont en suspension...
essaye de voir si tu peux prendre un support plus rugueux, du coup tu aurais plus de surface pour les interaction en tre ton support et l´aggregat