Séquences répétées inversées

[inviteb3cf22d0]

Bonjour à tous,

J'aurais aimé connaitre le rôle joué par les séquences répétées inversées en recombinaison homologue lors de l'invalidation d'un gène...

Merci pour votre aide.
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[inviteb3cf22d0]

Je vois que ma question ne rassemble pas les foules... Est-elle mal posée?
N'hésitez pas à me faire des remarques à ce sujet.

Bonne journée à tous

[inviteb3a6feac]

Bonjour,

Est-ce que vous voulez parler des séquences palindromes ?

[inviteb3cf22d0]

Pas exactement. Une séquence répétée inversée est contenue dans un vecteur par exemple afin d'inactiver un gène d'un génome. Cette séquence est constitué du gène en question (5'-3') et de la séquence de ce gène mais inversées (3'-5').

Suis-je clair???

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb3cf22d0]

Si on veux invalider un gène ATTCC par exemple contenu dans un gènome, on transforme le microorganisme par un vecteur contenant la séquence ATTCCCCTTA (soit la séquence du gène à invalider et la séquence du gène mais inverser).
Effectivement nowell, en relisant ce que j'écris, ça ressemble bien a une séquence palindrome.
Ma question est comment cette séquence peux aboutir à l'invalidation du gène contenu dans le génome???

[invite71f23525]

Bonjour,

C'est une stratégie utilisée pour modifier profondément le code du gène. Ainsi la séquence globale n'a plus rien à voir avec la protéine de base, on considère donc que le gène est invalidée. C'est souvent réalisé sur un exon, il est inséré à l'envers par recombinaison homologue, après avoir inversé les séquences flanquantes. Cela est donc assimilable à une mutation sur une grande longueur du gène.

Le problème est qu'on sait que le gène visé est invalidé, c'est évident, un exon entier qui ne code plus du tout les même acides aminés est assimilable à une autre protéine. C'est là où il pourrait y avoir un problème : celui de générer une nouvelle protéine avec de nouvelles fonctions. Malgré tout, cette stratégie d'invalidation permet aussi d'inclure les sites accepteurs et donneurs d'épissage. Ainsi l'inversion de l'exon et de ces sites accolés provoque une reconnaissance modifiée par le système d'épissage qui excise l'exon, considérant que c'est un intron. Il me semble que la tendance désormais est le système Cre-LoxP qui permet de réaliser cette inversion mais en plus de façon inductible. Il y a aussi le polyA-trapping avec insertion d'une résistance à la néomycine. Ici, on place la séquence d'intérêt par recombinaison homologue au niveau du premier intron, suivi du gène de résistance à la néomycine, suivi d'une séquence de polyadénylation stoppant prématurément la transcription du gène et l'invalidant. Le produit d'invalidation est alors la néomycine en fusion avec le début du gène invalidé, généralement un seul exon de ce même gène. Cela me semble déjà être moins biaisé et plus efficace.

Greg

[inviteb3cf22d0]

Merci beaucoup Greg pour ta réponse,

Je suis d'accord avec le fait que la séquence finale n'a plus rien a voir avec celle d'origine. Mais pourquoi utilisé la même séquence de manière inversée?? On peut supposer qu'une mutation ponctuelle suffisent à invalider le gène contenu dans le génome. C'est le fait d'utiliser la même séquence mais de manière inversée qui me pose problème...
Peux-tu m'éclairer sur ce point?

[inviteb3cf22d0]

Excuse-moi Greg,
J'ai relu ton explication et j'y ai trouvé la réponse à ma question.

Merci encore pour ton aide et bonne journée,

Mickaël

[invite71f23525]

Cela introduit une mutation profonde, affectant un pourcentage élevé de la partie codante du gène. Pour une mutation ponctuelle forte, la seule que je vois est une mutation non-sens qui va induire une dégradation des ARNm par le système de Non Sense Mediated Decay au niveau du ribosome. Ce système ne dégrade pas la totalité des ARNm en question ce ne serait donc pas aussi efficace que les méthodes utilisées actuellement, où on invalide brutalement le gène.

Greg

[inviteb3cf22d0]

Encore une fois, merci Greg.