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kinase




  1. #1
    Iforire

    kinase

    Bonjour,

    Beaucoup parle de kinase, proteine kinase, etc...
    Mais qu'est-ce qu'une kinase ?

    Merci de votre reponse !
    A plus.

    -----


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  3. #2
    Igothigh
    Citation Envoyé par Iforire
    Bonjour,

    Beaucoup parle de kinase, proteine kinase, etc...
    Mais qu'est-ce qu'une kinase ?

    Merci de votre reponse !
    A plus.
    Le terme kinase ou proteine kinase est un terme general pour definir une proteine qui catalyse le transfert d'un groupement phosphate issue de l'ATP sur un substrat proteique ou lipidique. C'est une reaction de phosphorylation. Leur contrepartie sont les phosphatases qui elles catalysent la reaction inverse, enlevement d'un groupement phosphate (reaction de dephosphorylation).
    La phosphorylation entraine un changement de charge de la proteine qui lui meme provoque des changements de conformation, qui peuvent, a leur tour, permettre la liaison d'autres proteines a la proteine nouvellement phosphorylee. Schematiquement, on peut imaginer la kinase comme un interrupteur qui, lorsqu'on appui dessus (l'active) peut simplement allumer une lumiere (resultat de la phosphorylation d'un substrat) ou mettre en route un mecanisme plus complexe pour effectuer une action (cascade de reaction lorsqu'une kinase active une autre kinase qui etc...).
    Tout comme un interrupteur, l'important est qu'il puisse etre allume ("on"), mais eteind aussi ("off"). Dans bon nombre de pathologie, dont le plus "populaire", le cancer, la fonction "off" n'existe plus entrainant une proliferation excessive des cellules ainsi affectees et une colonisation de l'organisme dans le pire des cas.

  4. #3
    Yoyo
    Salut,

    Un kinase est une ezyme qui rajoute un groupement phosphate (provenant d'une molecule appelee ATP) a une proteine.
    Ce groupement phosphate peut etre rajoute sur trois types d'acide amines: Tyrosine, Serine et threonine.

    l'jout d'un gorupement phosphate (fortement charge negativement) modifie generalement la structure de la proteine cible, permettant ainsi de reguler son activite


    Yoyo


  5. #4
    Iforire
    Merci pour ces reponses !

    En fait, j'ai un projet a faire sur ces petites betes, en gros sur la facon de les fabriquer industriellement.
    Connaitriez vous des sites interessant sur le sujet ? (kinase, production de kinase,etc...)
    Je chercher depuis toute a l'heure avec Google mais ce que j'ai trouve n'est pas extrement concluant.
    Merci !

  6. #5
    Yoyo
    De rien,

    et tu t'interesses a quel genre de kinase? porcaryotes? eukacryotes? deplus
    chaque kinase a une specificite assez forte pour tel ou tel substrat donc ca risque d'etre difficile de te rensiegner, d'autant que je ne connais pas les contraintes lies a la fabrication industrielle (taux de purification, organismes etc..)

    Desole de ne pas pouvoir te donner plus d'infos

    Yoyo

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Iforire
    Pas grave !
    En fait, c'est un peu a moi de deblayer tout ca et de me faire ma propre idee et de me concentrer sur quelques aspects uniquement.
    C'est pourquoi je cherche des sites plutot generalistes pour l'instant mais je n'en trouve que des specifiques a telles ou telles kinases, sans avoir de donnees industrielles.
    Merci quand meme,
    A plus !

  9. #7
    Igothigh
    Citation Envoyé par Iforire
    C'est pourquoi je cherche des sites plutot generalistes pour l'instant mais je n'en trouve que des specifiques a telles ou telles kinases
    Je pense que c'est lie a ce que dit Yoyo... chaque kinase a sa sensibilite et sa condition de purification. Tu auras du mal je crois a trouver une condition pour les kinases. Tu peux toujours partir des techniques de purification de proteine en general et essayer de voir si c'est adaptable a une kinase en particulier.

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  11. #8
    Yoyo
    Bonjour,

    J'ai une petite question "pratique" a propos de la phosphorylation.

    Quelqu'un a t'il une idee de la difference de migration electrophoretique provoquee par l'ajout d'un seul phosphate sur une proteine ?

    Mon probleme etant de savoir si la forme mono-phosphorylee d'une proteine est facilement differenciable de la forme non phsophorylee sans devoir faire d'electrophorese 2D.

    Merci d'avance si quelqu'un a une reponse

    yoyo

  12. #9
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    Quelqu'un a t'il une idee de la difference de migration electrophoretique provoquee par l'ajout d'un seul phosphate sur une proteine ?
    Le probleme est qu'il n'y a pas de regle generale. Surtout pour une seule phosphorylation, a moins que ce soit dans une region qui provoque un fort changement de conformation, tu verras peut-etre quelque chose en gel non denaturant, sinon c'est delicat. Avant de t'embarquer dans un gel 2D, il est peut etre preferable d'essayer une methode plus classique (a moins que tu aies l'habitude des gels 2D) comme un marquage P32 (en fait tout depend de ce que tu veux faire). Sinon, une methode que "j'aime bien" (j'ai horreur de manipuler le P32), c'est la spectrometrie de masse (si tu y as acces et si le centre tourne bien, sinon ca peut etre plus une perte de temps qu'autre chose...). Avec un peu de chance, tu peux determiner si ta proteine est phosphorylee et ou elle s'effectue.

  13. #10
    Yoyo
    Merci bien pour ta reponse.

    Donc si je comprends bien il y a toute les chance qu'une phosphorylation unique passe inapercu sur une proteine?

    Mon probleme est que je soupsonne une proteine qui m'interesse d'etre phosphorylee, mais probablement pas fortement (donc elle possede un ou deux phosphate au plus) et qu'en plus de ca elle doit etre en equilibre avec une forme non phosphorylee!

    C'est une proteine faiblement exprimee dans la cellule, donc difficile a purifier pour faire de la spectro de masse, et j'ai quelques resultats qui indiqueraient que la surexpression de la proteine sature le systeme de phosphorylation (donc impossible a utiliser pour purifier de grosses quantites).

    Yoyo

  14. #11
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    Donc si je comprends bien il y a toute les chance qu'une phosphorylation unique passe inapercu sur une proteine?
    Exact, meme si tu peux trouver un certain nombre d'exemples dans la litterature de simple phosphorylation qui provoque un changenment de migration. Ca depend aussi de la taille de ta proteine.

    Mon probleme est que je soupsonne une proteine qui m'interesse d'etre phosphorylee, mais probablement pas fortement (donc elle possede un ou deux phosphate au plus) et qu'en plus de ca elle doit etre en equilibre avec une forme non phosphorylee!
    Qu’est ce qui te fait penser qu’elle est phosphorylee? J’imagine que tu ne connias pas la kinase responsable de la phosphorylation?

    C'est une proteine faiblement exprimee dans la cellule, donc difficile a purifier pour faire de la spectro de masse, et j'ai quelques resultats qui indiqueraient que la surexpression de la proteine sature le systeme de phosphorylation (donc impossible a utiliser pour purifier de grosses quantites).
    C’est justement la puissance de la spectrometrie de masse, c’est que tu n’as pas besoin d’une grosse quantite de proteine pour voir quelque chose. Si tu as un moyen d’enrichir ta proteine (surexpression ou endogene) par IP par exemple, c’est generalement suffisant (ca te permet aussi de determiner si des proteines interagissent avec ta proteine d'interet!). Si tu ne peux pas utiliser ce genre de technique, tu peux juste utiliser un lysat cellulaire total et analyser les proteines d’un certain poids moleculaire apres migration sur gel ou meme (plus delicat quand meme) utiliser le lysat lui meme pour ne rien perdre.

  15. #12
    Yoyo
    Citation Envoyé par Igothigh

    Exact, meme si tu peux trouver un certain nombre d'exemples dans la litterature de simple phosphorylation qui provoque un changenment de migration. Ca depend aussi de la taille de ta proteine.
    Merci pour cette reponse . La taille predite de la proteine est de 76.5 KDa.

    Qu’est ce qui te fait penser qu’elle est phosphorylee? J’imagine que tu ne connias pas la kinase responsable de la phosphorylation?
    Eh bien non malheureusement je ne connais pas la kinase ni la phosphatase, mais au vu des resultats ca semble etre un mecanisme tres conserve chez les eucaryotes (des plantes, aux singes, en passant par la souris et la levure!)... malheureusement, meme si je ne m'y connais pas vraiment en kinases, j'imagine que ca ne permet pas d'identifier des candidats.
    Ce qui me fait dire que la proteine est phosphorylee est que le 2 amino-purine (un inhibiteur de kinase) affecte fortement la reaction dans laquelle cette proteine interviens. Maintenant il n'est pas imppossible que ca soit un effet plus indirect, mais je tente le coup...

    C’est justement la puissance de la spectrometrie de masse, c’est que tu n’as pas besoin d’une grosse quantite de proteine pour voir quelque chose. Si tu as un moyen d’enrichir ta proteine (surexpression ou endogene) par IP par exemple, c’est generalement suffisant (ca te permet aussi de determiner si des proteines interagissent avec ta proteine d'interet!).
    Merci pour cette info interessante, as tu une idee de la purite necessaire pour obtenir un bon resultat? si on se trouve dans un cas ou 60% des proteines sont phosphorylees et 40% ne le sont pas est-ce genant?


    Merci pour ton aide

    Yoyo

  16. #13
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    malheureusement, meme si je ne m'y connais pas vraiment en kinases, j'imagine que ca ne permet pas d'identifier des candidats.
    Plutot difficile. A moins de connaitre le site de phosphorylation, tu peux determiner les kinases candidates avec les amino acid environnant (et ca n'est deja pas tres evident!!). Sinon, tu peux toujours tenter un alignement des sequences connues des differents organismes et voir les domaines conservés. Avec de la chance (pas mal meme), tu pourrais determiner les S, T, Y potentiellements phosphorylables... resterait a determiner les kinases potentielles... mais bon, c’est un peu chercher une aiguille dans une botte de foin a mon avis!!

    Ce qui me fait dire que la proteine est phosphorylee est que le 2 amino-purine (un inhibiteur de kinase) affecte fortement la reaction dans laquelle cette proteine interviens. Maintenant il n'est pas imppossible que ca soit un effet plus indirect, mais je tente le coup...
    Tu peux essayer de restraindre les kinases candidates en utilisant des inhibiteurs plus specifiques.

    Merci pour cette info interessante, as tu une idee de la purite necessaire pour obtenir un bon resultat? si on se trouve dans un cas ou 60% des proteines sont phosphorylees et 40% ne le sont pas est-ce genant?
    C’est aussi un avantage de la mass spectrometry, c’est que tu n’as pas besoin de reellement purifier la proteine. Si tu l’enrichis (comme avec une IP), tu facilites l’analyse. mais theoriquement, meme une proteine noye parmi des centaines, milliers etc... d’autres, tu doit pouvoir savoir si elle est presente. Pour la phosphorylation, c’est pareil. Je ne connais pas le seuil a partir duquel tu peux absolument dire si tel ou tel peptide est phosphoryle. Mais la phosphorylation change la masse du peptide de... hum.. je ne me rappelle plus mais suffisament pour voir que quelque chose a changer et pas trop pour ne pas le confondre avec un autre peptide. Avec des controles adequats, ca peut te mettre sur des pistes que tu pourras verifier ensuite par d’autres methodes.


    Merci pour ton aide
    Y'a pas de quoi

  17. #14
    seb
    Iforire
    Juste pour rajouter mon grain de sel , je sais quelque chose par expérience les kinases sont très difficiles à produire !!! Et d'ailleurs il ya peu de boites qui vendent des kinases actives purifiées (s'il y en a)
    Les problèmes pour la production sont de plusieurs ordres :
    -toxicité cellulaire : les cellules qui produisent en grande quantité la kinase ne le supporte pas

    - solubilité : in cellulo il en résulte la formation de corps d'inclusions (cristaux de protéines à l'intérieur des bactéries) qui sont très difficiles à récupérer. Même dans des systèmes de traduction in vitro les kinases peuvent précipiter et devenir insolubles.

    Bref c'est un problème interressant et si tu trouves une solution simple je serais le premier interressé

    Yoyo

    T'as des anticorps contre ta protéine ?
    si oui un western à partir d'un gel gradient devrait t'apporter rapidement une réponse, en tout cas ça se teste. J'ai vu de mes yeux vu par chez nous des triplets bien visibles dus à des différences d'un phosphate.
    Sinon l'approche spectro de masse peut être interressante si tu es pote avec le chargé de la plateforme ou si tu t'ouvres vers une collaboration...l'avantage c'est que tu pourras avoir la séquence qui est phosphorylée sur ta protéine. Ce qui peut donner à un petit papier une autre gueule ;o)

    A+

    seb

  18. #15
    Yoyo
    Merci a vous deux pour vos reponses.

    Je suis plutot content qu'une difference d'un phosphate ne soit pas forcement visible, car dans les papiers que j'ai vu en western on en voit qu'une bande alors je me demandais s'il etait possible que la difference ne soit pas observable si ce n'est pas ce que l'on cherche a montrer.

    Citation Envoyé par Igothigh
    Sinon, tu peux toujours tenter un alignement des sequences connues des differents organismes et voir les domaines conservés. Avec de la chance (pas mal meme), tu pourrais determiner les S, T, Y potentiellements phosphorylables...
    C'est ce que j'ai effectué pour demarrer, maintenant j'en suis a muter les sites un par un pour voir si ca aura un effet!...


    Tu peux essayer de restraindre les kinases candidates en utilisant des inhibiteurs plus specifiques.
    Tu aurais une liste d'inhibiteurs avec leur specificites ?

    Yoyo

  19. #16
    seb
    Tu aurais une liste d'inhibiteurs avec leur specificites ?
    Je crois que les catalogues de sigma et calbiochem pourront faire ton bonheur mais à part si tu es dans un labo milliardaire je te conseille de cibler tes hypothèses ;o)

  20. #17
    Igothigh
    Citation Envoyé par seb
    Et d'ailleurs il ya peu de boites qui vendent des kinases actives purifiées (s'il y en a)
    Si, si, il y en a.

    Citation Envoyé par Yoyo
    C'est ce que j'ai effectué pour demarrer, maintenant j'en suis a muter les sites un par un pour voir si ca aura un effet!...
    J'espere pour toi que tu n'en a pas trop

    Tu aurais une liste d'inhibiteurs avec leur specificites ?
    Comme ca vite fait, ceux que j'ai deja utilise:

    - UO126 et PD98059: inhibiteur de MEK (PD98059 empeche l'activation de MEK mais n'a pas d'effet sur MEK active, UO126 inhibe tout)
    - GF10...X je n'ai plus le nombre en tete: inhibiteur de PKC
    - PP1 inhibiteur de Src
    - genistein, staurosporine... certains disent que c'est specifique de certaine kinase (PKA, pKC peut-etre)... mais je ne le crois pas etant donne (la staurosporine) que c'est un analogue de l'ATP non hydrolysable.

    Tu peux aussi essayer de forcer le systeme en inhibant les phosphatases:
    - orthovanadate de sodium (Na3Vo4): spectre tres large
    - okadaic acid (inhibiteur de PP2A, mais plus vaste a plus forte concentration)
    - calyculinA inhibe la phosphatase PP1 et aussi plus vaste a plus forte concentration

    Mais sinon, comme le suggerait seb, un certain nombre de catalogue comme Calbiochem propose une panoplie d'inhibteurs.

  21. #18
    seb
    Citation Envoyé par Igothigh
    - PP1 inhibiteur de Src
    celui-là je le déconseille vivement: plus non-spécifique il ny' a pas , je crois d'ailleurs qu'il n'est même plus commercialisé. Préfères le PP2 qui est plus spécifique des src family kinases (quoiqu'il croise avec le récepteur à l'EGF avec une ic50 de 150nM si mes souvenirs sont bons).
    Pour inhiber le domaines kinase du récepteur à l'EGF il y a l'AG1478
    Pour inhiber les JAK (Janus kinases) l'AG1490

    Méthode plus originale pour voir un shift , traites ton Ip avec une phosphatase purifié (ça se vend pas trop cher chez amerscham je crois). Controle/traité--> beau shift de déphosphorylation.

  22. #19
    Yoyo
    Dans un premier temps je me concentre sur 5 sites potentiels dont un qui semble bien meilleur que les autres apres on verra

    d'apres prosite les sites de phosphorylation correspondent aux kinases suivantes:
    - cAMP kinase
    - CK2 phosphorylation
    - PKC phosphorylation

    Ca vous dit quelque chose? vous connaissez des inhibiteurs que je pourrais utiliser soit in vitro, soit in vivo.

    tiens en parlant de ca, vous connaissez le mode d'action du 2 amino-purine?


    Citation Envoyé par seb
    Méthode plus originale pour voir un shift , traites ton Ip avec une phosphatase purifié (ça se vend pas trop cher chez amerscham je crois). Controle/traité--> beau shift de déphosphorylation.
    Ben oui, mais je pense que le shift de phosphorylation n'est pas suffisant pour voir la difference en electrophorese.

    Yoyo

  23. #20
    seb
    pour les PKcs t'as la série des inhibiteurs GFX ou les Gö ça doit être calbiochem qui fait ça, si tu veux je me renseigne je connais quelqu'un qui bosse dessus.
    Mais au fait ta prot elle est bien cytosolique ?

  24. #21
    seb
    Sinon comme kinases problables qui se rapporcherait plus de chez toi , tu pourrais avoir la p70S6kinase qui phosphoryle la petite sous-unité ribosomique ou les polo-kinases qui aiment bien les complexes de la coiffe et des IRES.

    Mais au fait tout bête....une immunoprécipitation anti-ta protéine et un blot anti-phosphotyrosine ou phosphoS/T !!!! (en priant que ce soit une phosphotyr car les anticorps antiposhphoS/t bof bof)

    Je me rend compte que ce fil doit être aussi incompréhensible pour les autres que les fils d'éléctroniques le sont pour moi !

    A+
    s
    eb

  25. #22
    Yoyo
    Bonjour,

    Merci pour ces infos, je ne savais pas qu'il existait des anticorps specifiques anti-tyr-phos ou ser/thr!

    La technique au P32 est semble t'il la plus sensible, le probleme est qu'il faut avoir les etuves et tout le materiel pour travailler avec la radioactivite sous hote! et je crois pas que la division soit equipee (faut que je verifie). Sinon l'alternative serait de faire ca avec un systeme in vitro (genre RRL ou WG) ca devrait bien marcher non ?... mais je ne sais pas trop les rendements que je peux attendre!
    Sinon oui ma proteine est une proteine cytoplasmique, en revanche elle n'est pas impliquee dans la morphogenese du ribosome, et ne semble avoir qu'un role tres indirecte dans l'initiation coiffe dependante.

    Si vous avez d'autres conseils n'hesitez pas

    Yoyo

  26. #23
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    Merci pour ces infos, je ne savais pas qu'il existait des anticorps specifiques anti-tyr-phos ou ser/thr!
    Comme le disait Seb, les anti-phospho-tyr marchent relativement bien (meme si ca depend de l'environnement de l'acide amine phosphoryle), les anti-phospho-ser et thr, c'est plus qu'aleatoire. Un anti-phosphotyrosine que j'aime bien, c'est le clone 4G10.

    La technique au P32 est semble t'il la plus sensible,
    Definitivement oui...

    le probleme est qu'il faut avoir les etuves et tout le materiel pour travailler avec la radioactivite sous hote! et je crois pas que la division soit equipee (faut que je verifie)
    Tu n'as pas besoin de materiel tres particulier pour travailler avec le P32 (a moins qu'en Angleterre la legislation soit plus stricte qu'ailleurs). Un ecran de plexiglas, des containers pour recuperer les dechets et le tour est joue. Il n'y a que les compose tres volatiles et particulierement dangeureux comme l'iode 125 qui necessite de travailler sous une hote.
    Il faut juste faire un peu plus attention si tu fais du labelling in vivo (incuber les celluels avec le P32).
    Un test que tu peux tenter juste pour savoir si ta proteine est phosphorylee et dans le cas ou tu peux immunoprecipiter ta proteine est de faire une immunoprecipitation dans differente condition de stringence et incuber ton immunoprecipitation dans un tampon de reaction adequate pour les kinases avec de l'ATP32. Avec un peu de chance, tu peux coprecipiter la kinase qui phosphoryle ta proteine et le reveler par cette methode. Je peux t'envoyer une reference (tres bonne ) pour que tu aies une idee de la methode si tu veux.

    genre RRL ou WG
    Quels sont ces systemes?

  27. #24
    Yoyo
    Salut,

    Pour ce qui est des kinases, d'apres prosite et les liens que j'ai donne ci-dessus, mes sites sont des Ser/Thr et pas des Y!

    Ils sont assez strictes sur les conditions d'utilisation de la radioactivite, mais ca rejoins la maniere dont tu dis. Ce qui me pose plus probleme est de devoir ammener mes boites de culture (contenant mes cellules) avec dedans du P32...les autres risquent de pas apprecier (risque de contamination de la hote). Quand je parlais de hote, je pensais a une hote pour les cellule afin d'etre en conditions steriles

    Sinon oui, je veux bien voir a quoi ressemble ton (tres bon) protocole

    RRL= systeme de traduction in vitro de reticulocyes de lapin
    WG = systeme de traduction in vitro de germe de bles.

    Yoyo

  28. #25
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    Ce qui me pose plus probleme est de devoir ammener mes boites de culture (contenant mes cellules) avec dedans du P32...les autres risquent de pas apprecier (risque de contamination de la hote). Quand je parlais de hote, je pensais a une hote pour les cellule afin d'etre en conditions steriles
    Le probleme est plus pour l'incubateur effectivement. Meme si le P32 n'est pas tres volatile, mis dans un milieu de culture a 37, ca peut etre un probleme. Ceci dit, on fait ca ici dans une piece isolee et on n'a jamais eu de probleme de contamination de l'incubateur. Sinon, je ne pense pas que tu aies besoin d'une hote pour faire les manip. Les temps d'incubation avec le P32 sont relativement cours (4 a 8h) et a moins de bosser comme un cochon, le risque de contamination par perte de sterilite est proche de 0. Les cellules risquent plus de mourir par exposition au P32 plutot que par une infection

    Sinon oui, je veux bien voir a quoi ressemble ton (tres bon) protocole
    Avec plaisir

    RRL= systeme de traduction in vitro de reticulocyes de lapin
    WG = systeme de traduction in vitro de germe de bles.
    OK, merci.

  29. #26
    Yoyo
    Bon encore une petite question pour nos pro des phospho tyrosines

    En fait il y a un seul site Y phosphorylable sur cette proteine. Le seul probleme est qu'il n'existe pas dans l'organisme modele que je peux utiliser. Alors je me dis que je devrais pouvoir tester la phospho de la tyr in vitro.

    Mon idee est la suivante.
    Incuber mon lysat de réticulocyte de lapin, avec un anticorps anti-Y-phospho.
    Si la protéine à la quelle je pense, est bien Y-phospho alors l'anticorps devrait se fixer dessus et bloquer ainsi son activité. L'inactivation de la proteine en question pouvant etre suivi par un test enzymatique, je devrais pouvoir quantifier précisément l'effet de l'anticorps.
    Comme temoin je pourrais utiliser un anti-ser/thr, ou un anticorps totalement differents.

    vous en pensez quoi?

    Yoyo

  30. #27
    coco
    Moi je trouve ça très bien!!! (pour ce que j'ai compris...)
    Mais je voulais quand même demander, pour le témoin, as-t-on besoin d'ajouter un anticorps quelconque?, sans ajoût d'Ac, n'est ce pas un témoin?

  31. #28
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    En fait il y a un seul site Y phosphorylable sur cette proteine. Le seul probleme est qu'il n'existe pas dans l'organisme modele que je peux utiliser. Alors je me dis que je devrais pouvoir tester la phospho de la tyr in vitro.
    Je n'ai pas vraiment compris ca... Qu'est ce qui n'existe pas? Si tu parles de la Tyr et qu'elle n'est pas conservee, est ce que ca vaut la peine de voir si elle est phosphorylee?

    Mon idee est la suivante.
    Incuber mon lysat de réticulocyte de lapin, avec un anticorps anti-Y-phospho.
    Si la protéine à la quelle je pense, est bien Y-phospho alors l'anticorps devrait se fixer dessus et bloquer ainsi son activité.
    Je pense que cette approche est un peu trop hasardeuse et que si ca marche ou ne marche pas, tu ne pourras pas vraiment conclure. Je vois au moins 3 problemes.
    1) tu pars du principe que l'anticorps est bloquant. Or, tu n'es pas sur qu'il va bloquer ni meme reconnaitre ton site de phosphorylation. S'il est bloquant, il va bloquer un tas d'autres proteines phosphorylee sur Tyr dans le lysat. Tu ne sauras pas si c'est ta proteine qui est bloquee ou une autre necessaire a l'activation de ta proteine.

    2) je n'ai jamais utilise de reticulocyte de lapin, mais es tu sur que la kinase supposee phosphoryler ta proteine est presente et sera active dans le reticulocyte?

    3) pour le controle, il faudrait mieux utiliser un autre anticorps que ceux diriger contre des phosphorylations. Si jamais ils ont un effet bloquant et que ta proteine est cible, tu pourrais avoir un effet dans le temoin... Et s'il est bloquant, meme remarque que pour l'anti P-Y.

    Le principal probleme est que tu ne sais pas si ta proteine est phosphorylee. Je crois que c'est la premiere chose a faire parce ue meme si, en supposant que ca marche comme tu l'as prevu, il faudra le verifier ensuite... Donc autant commence par ca, ca leve un doute assez pesant... en tout cas, c'est mon avis

    Mais je voulais quand même demander, pour le témoin, as-t-on besoin d'ajouter un anticorps quelconque?, sans ajoût d'Ac, n'est ce pas un témoin?
    Le probleme est qu'il faut en general etre sur que l'effet que tu vois ne soit pas du a ce que tu ajoutes dans ta reaction. Bien que ce ne soit parfois pas tres rationnel (les bons controles sont souvent difficile a trouver), on ajoute toujours quelque chose qui se rapproche le plus du compose suppose etre actif. En general, quand il s'agit de toxine, d'inhibiteurs etc... on ajoute le solvant, mais dans ce cas, comme on ajoute une proteine qui a une activite non negligeable, l'anticorps, il est bien d'ajouter le meme type de proteine mais qui n'a pas la meme specificite pour etre sur qu'il n'y a pas une reaction aspecifique inattendue de la partie conserve de l'anticorps par exemple qui menerait a une conclusion attive et fausse.

  32. #29
    Yoyo
    salut,

    Merci pour ta reponse Igothigh. C'est bien ce a quoi j'avais pense! il vaut mieux d'abord montrer une phosphorilation. En fait j'ai trouve un papier ou les auteurs montrent que la phosphorylation de leur proteine n'est visible que dans un mutant affectant la phosphatase! je pense que je risque d'etre dans ce cas la moi aussi!

    juste deux petites choses pour preciser:
    2) je n'ai jamais utilise de reticulocyte de lapin, mais es tu sur que la kinase supposee phosphoryler ta proteine est presente et sera active dans le reticulocyte?
    Oui j'en suis sur vu que mon inhibiteur est actif dedans.

    Je suis d'accord avec toi concernant les points 1 et 3.

    Le probleme est qu'il faut en general etre sur que l'effet que tu vois ne soit pas du a ce que tu ajoutes dans ta reaction. Bien que ce ne soit parfois pas tres rationnel (les bons controles sont souvent difficile a trouver), on ajoute toujours quelque chose qui se rapproche le plus du compose suppose etre actif. En general, quand il s'agit de toxine, d'inhibiteurs etc... on ajoute le solvant, mais dans ce cas, comme on ajoute une proteine qui a une activite non negligeable, l'anticorps, il est bien d'ajouter le meme type de proteine mais qui n'a pas la meme specificite pour etre sur qu'il n'y a pas une reaction aspecifique inattendue de la partie conserve de l'anticorps par exemple qui menerait a une conclusion attive et fausse.
    J'ai rien a ajouter la reponse est precise claire et tout et tout

    Yoyo

  33. #30
    Igothigh
    Citation Envoyé par Yoyo
    En fait j'ai trouve un papier ou les auteurs montrent que la phosphorylation de leur proteine n'est visible que dans un mutant affectant la phosphatase! je pense que je risque d'etre dans ce cas la moi aussi!
    D'une maniere generale, lorsque tu cherches a montrer une phosphorylation, tu utilises des anti-phosphatases dans ton tampon d'extraction de la proteine ou de lyse des cellules. Rien ne t'empeche de l'utiliser dans ton lysat de reticulocyte. Celui utilise est souvent l'orthovanadate de sodium, tres efficace et spectre tres large.
    Alors, qu'est ce que tu vas faire, "Tchernobyl" ou tester les anticorps?

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