Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

[inviteac276b84]

Bonjour à tous,
Je me présente (je suis nouveau) : je suis étudiant en 2e année de thèse et fait la plupart du temps de la biochimie et de la biologie moléculaire.
J'ai fais l'observation que certaines tumeurs expriment une protéine membranaire normalement exprimée dans le rein. Pour voire ça j'ai utilisé dans un premier temps la technique de PCR temps-réel avec un couple d'amorce (qiagen) dans la partie centrale du messager. Dans un deuxième temps j'ai produit un anticorps reconnaissant cette protéine et j'ai fait un western avec l'anticorps purifié. J'observe alors une bande au bon poids et d'autres plus petites (ne fait pas une smire, il n'y a "que" 3 bandes de plus).
Je me demande donc si je n'ai pas des formes plus courtes de la protéine.

Donc ma question est : Comment savoir si les messagers que je vois en q-PCR sont tous entiers ? (ou peut-être de façon plus large comment montrer qu'il y a des protéines tronquées et des protéines entières dans ces tumeurs ?)

Est ce que la technique de la 5'RACE PCR est adaptée ? Si oui est ce facilement réalisable ?
Est ce visible en simple séquençage (sachant que je risque d'avoir un mélange d'ARNm entier et tronqué dans mes échantillons)?
Est ce la peine de s'interresser à cela sachant que j'ai de toutes façons une protéine entière présente ???

Merci d'avance pour vos réponses

PS : n'hésitez pas à me demander des informations supplémentaires si besoin est.
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[invite160a5434]

Bonjour,

Je n'ai pas ton niveau mais je vais essayer de raisonner avec toi.

Avant toute chose, dans quel organisme te trouves-tu ? Est ce qu'il y a de l'epissage, parce que l'épissage expliquerait en partie tes résultats.

Ensuite,je pense que pour caractériser les différents types d'ARNm qui sont présent, moi j'opterais pour des sondes spécifiques des exons, pour savoir quelles parties de ton ARNm sont utiles à la bonne conformation de la protéine.

Cela soulève un dernier point : est ce que tes ARNm de différentes tailles sont bien caractéristiques de ta protéine et est ce que leur différentes tailles produisent des protéines viables.

Bonne chance

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura,

Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...?), la protéine recombinante?

Si ce sont des extraits que tu as déposé, les autres bandes sont soit du non spé, soit des formes modifiées de la protéine comme des phosphorylations qui peuvent provoquer d'importants shifts de migration, soit des isoformes mais pour moi ce n'est pas la première piste à explorer. Je ne sais pas exactement ce que tu veux faire ensuite, mais il me semble que le plus important est de repérer la bande correspondant à la forme de ta protéine qui t'intéresse et d'y rester dessus.

Qu'est-ce qui te fait douter et t'oriente vers des isoformes de ta protéine?

Greg

[gorben]

Salut,

Tu as au choix :

- Northern blot
- qPCR en 5', au milieu et en 3'

Je pense que le northern est de tres loin la meilleure methode. De plus, ce sera celle qui sera le plus facilement acceptee dans un article.

Sinon tu peux aussi "tagger" ta proteine en Ct et Nt (techniquement possible chez les eucaryotes?) et voir si tu as une difference. Le northern blot reste quand meme la meilleure voie.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteac276b84]

Tout d'abord merci beaucoup pour vos réponses !!!

Alors pour vous répondre dans l'ordre :
toYtoY
Je travail sur des tumeurs humaines et effectivement il y a de l'épissage. On a déjà observé de l'épissage sur des protéines analogues à la mienne et ça pourrait expliquer effectivement mes plusieurs bandes. Cependant l'épissage qui a été observé ne fait sauter que quelques acides aminés et si j'ai le même phénomène ça n'explique pas que je perde + de 50% de la taille de ma protéine... mais effectivement je doit garder ça à l'esprit merci

LXR
Alors effectivement sur mon western j'ai fait migrer un extrait membranaire de rein et en parallèle un extrait membranaire d'une lignée cellulaire exprimant de façon endogène ma protéine. Les bandes "surnuméraires" que j'observe dans la lignée sont également présentes dans le rein. C'est effectivement peut être du non spé...
Tu me dis que des modifications de la protéine peuvent entrainer de gros shift lors de la migration. Est-ce que ça peut expliquer mes résultats : une bande attendue à 100 kDa, plus 2 autres à 60 kDa (doublet) et une dernière à 30 kDa?
Autrement, ce qui me fait penser que ça pourrait être une nouvelle isoforme, c'est que dans une protéine très proches, il a été observé des sites d'initiation alternatif qui donne naissance à des protéines entières et tronquées. De plus, en faisant des PCR le long de mon messager, j'observe qu'il y a des zones beaucoup plus difficiles que d'autres à amplifier (mais ça peut s'expliquer de plein de façons je pense...).

La suite du projet, est de faire du SiRNA sur la lignée tumorale exprimant ma protéine et de voire si les caractéristiques tumorales change. Donc les histoires d'isoformes ne me bloquent pas vraiment. C'est simplement par curiosité et en me disant que mon travail serait plus complet si je ne passe pas ça sous silence... mais je me trompe peut-être

Gorben
Donc le northern te parrait être le mieux.
Ok... dans mon labo personne n'en fait... ...

Mais je vais peut-être aller au plus simple comme me le recommande LXR . M'occuper de la protéine entière.
En plus en écrivant cette réponse je me rend compte que quand je passerais au SiRNA, si je vois les autres bandes disparaitre en même temps que celle au bon poids alors j'aurais une partie de ma réponse, à savoir est ce du non-spé ou bien ma protéine.

En tout cas Merci à tous.
a+
Vince

[invitec9f0f895]

Salut

L'idée d'ARN tronqués me semble la plus compliquée, surtout qu'il est probable que tes bandes inférieures soient de la dégradation. L'as tu vérifié?
Sinon je suis d'accord avec Gorben, le nothern est la solution la plus simple pour vérifier la taille des ARNm!
Ceci etant dit, un ARNm tronqué à son extrémité 5' risque de ne pas etre traduit a cause de l'absence du codon AUG, et s'il est tronqué en 3' alors aucune protéine ne sera produite car l'absence du codon stop provoque la dégradation de l'ARNm et de la protéine traduite.

YOyo

[invite71f23525]

En plus en écrivant cette réponse je me rend compte que quand je passerais au SiRNA, si je vois les autres bandes disparaitre en même temps que celle au bon poids alors j'aurais une partie de ma réponse, à savoir est ce du non-spé ou bien ma protéine.

Cela dépend de ton siRNA. Si c'est un pool de siRNA qui cible toute la longueur de l'ARNm, alors tu auras pas mal de chance pour que les isoformes soit éteint (si isoforme il y a). Dans le cas contraire, certains risquent de passer au travers des mailles. D'autre part, les siRNA peuvent donner des résultats très bizarres. Toutes les bandes risquent de ne pas suivre le même profil, certaines bandes risquent même d'être stimulées par le siRNA spécifique de ta protéine... En plus de ça, si les autres bandes suivent le même profil d'extinction que la bande à 100 kDa, cela n'apportera aucune preuve d'isoformes. Les bandes inférieures peuvent avoir leur expression régulée par le niveau d'expression de la protéine à 100 kDa, ce qui ne nécessite pas qu'ils soient des isoformes de celle-ci.

En revanche si tu as une idée des séquences des différents ARNm, tu peux tester des siRNA spécifiques à chacune des formes. Ainsi tu peux voir si les bandes inférieures diminuent. Mais encore une fois, ce genre de résultat seul ne veut rien dire.

Greg

[inviteac276b84]

Salut
Ceci etant dit, un ARNm tronqué à son extrémité 5' risque de ne pas etre traduit a cause de l'absence du codon AUG, et s'il est tronqué en 3' alors aucune protéine ne sera produite car l'absence du codon stop provoque la dégradation de l'ARNm et de la protéine traduite.
YOyo

Ce qui m'a fait allé vers cette idée c'est que j'ai vu d'autres méthionines avec un A en -3 et un G en +4 (sequence Kosac) je me disais donc que l'initiation aurait pu commencer sur ces autres méthionines.

Mais j'ai l'impression que vous penser que c'est un peu tiré par les cheveux...
A force d'avoir le nez dans les manips on s'égare un peu et je crois que je vais me recentrer sur le vif du sujet ^^ donc merci de vos remarque ça m'a bien aidé.

C'est quand même génial de pouvoir discuter sur ce forum de problèmes très techniques et précis. Ça permet d'avoir d'autres points de vu que celui de son chef

Autrement pour le SiRNA Greg, je n'avais effectivement pas pensé à tout ça. Donc en gros si je veux plus tard revenir sur ce petit problème, je pense que je serais obligé de faire un northern.

Merci à tous

Vince

[invite7825c20b]

Salut

Pour vérifier l'intégrité de l'ARN, ce qu'on peut faire c'est RT PCR circulaire. Tu extrait les mRNA, ligation sur eux mêmes puis PCR. Mais je sui d'accord avec les autres l'explication dues aux ARN me parait pas convaincante?

[inviteac276b84]

ok
je ne connaissais pas cette technique
merci