Probleme de ligase?

[Enialix]

Bonjour à tous,

j'ai un petit soucis de ligation, et je ne vois pas du tout d'où cela peu provenir.

Je doit insérer plusieurs inserts différents dans plusieurs plasmides différents, ce qui me fait penser que le problème ne vient ni des vecteurs, ni des inserts.

Je commence par digérer mes vecteurs et inserts avec NotI et XhoI, je dépose sur gel, où je vois pile les bande que je devrais voir. Je découpe le gel, je purifie, je redépose sur gel pour être sûr. Là encore de belles bandes aux bonnes tailles.

Je procède alors à la ligation, je crois avoir presque tout tester, ratio insert/vecteur différents, temps de ligation, température de ligation... .

Puis je transforme, et là ... rien, aucune colonie.

Je me suis alors demandé si le soucis ne venait pas de la transfo ou de mes DH5a compétente, j'ai donc fait des test et tout va bien de ce coté là.

Le problème viens donc forcement de la ligation, mais j'avoue que je sèche.

Si vous avez des idées je suis preneur

Merci d'avance, et bonne journée.
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[gorben]

Salut,

Dans l'ordre du plus probable au moins probable je dirais :
- tes inserts/plasmides sont mal digeres
- ta purif sur gel pourri tes inserts (TBE? UV?)
- tes inserts sont trop gros/trop petits
- tes inserts sont toxiques pour la cellule

A+

[Enialix]

Bonjour Gorben, merci de ta réponse, ma question n'ayant pas attiré les foules ^^.

Pour le premier points, je laisse digérer jusqu'a 2h, et les bandes que je découpe sur gel sont bien à la bonne taille, peuvent-il quand même être mal digérés?

Il est ensuite possible que la purif soit pourri, j'utilise du tampon TAE, et j'essaie d'exposer le moins possible aux UV, il faudrait que j'expose encore moins longtemps.

Pour la taille vecteur/insert, j'en ai de toute sorte, insert de 1000pb dans 5700pb, insert de 4500pb dans 5700pb, insert de 1000pb dans 2700pb...

Et pour finir je ne pense pas que mes inserts soient toxiques car je les ai dans d'autre plasmides, et là, aucun soucis.

Je suis d'ailleurs parvenu hier à faire une construction (1000pb dans 5000pb), je n'avais qu'un seul clone sur ma boite, et il était bon (au vu de la digestion analytique, je vais séquencer pour être sûr), je l'ai reptransformé, et ce matin j'avais pleins de clone, à la limite du tapis, donc pas toxique ^^.

Cela fait des semaines que je galère avec ces constructions, je commence à craquer, mais la science vainquera .

Encore merci.

[inviteb94d8e21]

Ca ressemble siot à un problème de ligation, soit à un problème de transformation.
1/ Calcule to efficacité de transformation, si elle est en dessous de 10^6 colonies /ug de pUC18 (ou un plasmide de petite taille équivalent), jette tes bactéries et reprépares-en d'autres (ou achètes-en d'autres). Je vois trop d'étudiants me dire "j'ai transformé 1ug de plasmide et j'ai un tapis, donc mes bactos sont OK". Des bactéries à 10^4 colonies/ug donneraient aussi un tapis avec 1ug de plasmide, pourtant elles seraient impropre à la plupart des constructions.

2/ Je n'aime pas trop que les deux partenaires d'une ligation soient extraits d'un gel, ça diminue pas mal l'efficacité de ligation. Il vaut mieux purifier uniquement le fragment sur gel et traiter le vecteur à la phosphatase (+ extraction phénol après, of course).

3/ Une astuce pour se débarasser du problème des UV est d'utiliser du SYBERSafe à la place du BEt. On peut le visualiser en lumière bleue (dans les longueurs d'ondes visibles, donc) ça ne casse pas l'ADN.

4/ Pour tester l'activité de ta ligase, dépose une partie de ta réaction de ligation sur gel. Tu doit voir monter l'ADN dans les hauts poids moléculaires. Ceci dit ça ne te dira pas si c'est ta ligase qui est naze ou tes fragments qui ne sont pas propres. Pour trancher, il te déposer sur gel une réaction de ligation faite avec des fragments propres (qui n'ont pas été extraits d'un gel).

I hope it helps.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Enialix]

Merci,

je vais tenter tout ca, je verrais biens si cela fonctionne.

1) Point de vue bactéries, j'ai transformé avec seulement 5ng de plasmide (de 6000pb) c'est à dire pas beaucoup de copies.
Les 10^6 sont très largement atteints pour 1µg d'un petit vecteur.

2)Pour le vecteur tu propose donc que je digère avec mes enzymes, que je traite à la phosphatase (pour éviter une religation je suppose), que je fasse une extraction au phénol, et qu'ensuite je me serve de cela (avec l'insert bien entendu) pour faire la ligation.

3) Nous avons je crois des gens qui utilisent du SyberSafe au labo, mais il me semble qu'ils le visualisent sous UV car pas d'appareil à lumière bleue.

4) Je vais refaire des ligations et déposer sur gel, cela me donnera une idée en effet.

Encore merci.

[inviteb94d8e21]

Pour le point 2/:

Le traitement phosphatase évite effectivement la recircularisation de ton vecteur (le petit bout de linker entre tes deux sites de restriction traîne toujours dans le tube). Si tu as une phosphatase thermosensible, ça vaut le coup de chauffer la réaction avant l'extraction au phénol. S'il reste la moindre trace de phosphatase pendant la réaction de ligation, ça va déphosphoryler aussi ton fragment et rendre la ligation impossible. Dernier point : l'extraction au phénol est toujours suivie d'une précipitation à l'éthanol, mais je suppose que tu le savais déjà.

La PO4ase alcaline d'intestin de veau (CIP) fonctionne très bien dans tous les tampons d'enzymes de restriction. Pour déphosphoryler un vecteur, j'ajoute une pouillette (0.5 ul sans me poser de question, c'est toujours un large excès) de PO4ase directement dans la réaction de digestion 1/2 heure avant la fin de ma réaction de digestion et je termine l'incubation.

Bonne chance.