Contamination d'ARN par de l'ADN

[invite2936c094]

Bonjour,

Je viens de rechercher sur le net des explications sur la contamination ADN que j'obtiens en réalisant mes extractions ARN et je suis tombée sur le forum de futura science où en janvier 2003 yoyo indiquait qu'il y a certaines taq qui peuvent reverse transcrire de l'ARN.

J'ai réalisé un traitement DNase de mes ARN lors de l'extraction ARN mais lorsque j'essaie d'amplifier mes ADNc avec des primers se trouvant dans le promoteur de mon plasmide ou à l'extérieur de mon ORF (après le teminateur et dans le promoteur), je sort toujours quelque chose, or je ne devrait pas puisque je recherche des ARNm (RT avec oligodT) qui, si mes souvenirs sont les bons, correspondent uniquement à l'ORF (ATG au STOP).

J'ai alors suivi votre conseil: j'ai RNasés mes ARN DNasés et j'ai réalisé une PCR directement sur cette condition, je n'ai rien obtenu.

Lorsque j'ai refait le test, j'ai testé en même temps sur des ARN DNasés, des ARN DNasés RNasés et des ARN non DNasés RNasés , voici les résultats de PCR sur ARN avec des primers toujours dans le promoteur:

DNasé NON RNasé : amplification dûe à la Taq?


DNasé + RNasé : rien

Non DNasé + RNasé: amplification, il reste donc de l'ADN après mon extraction ARN.

J'ai alors testé avec une Taq haute fidélité et les résultats sont identiques!!

Quelle Taq pourrait me donner une réponse clair?
J'ai prévu de refaire des tests avec des souches ne possédant pas de plasmide et de rajouter une quantité de plasmide en DNasant ou non les extractions.

Si vous avez une explication sur ces résultats merci de me tenir au courant, je commence un peu à m'arracher les cheveux...
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[piwi]

J'ai du mal à comprendre ce que vient faire le plasmide dont vous parlez et ce que vous cherchez à réaliser.

Pourriez-vous être un peu plus clair?

Cordialement,
piwi

[invitec9f0f895]

Salut

Personnellement je n'ai trouvé aucune taq qui n'ait pas une activité RT de base (je n'en n'ai pas tester 50 non plus).

Si ta bande disparait apres traitement a la RNAse c'est que tu as de la RT ! Je pense que la réponse est claire.

Sinon fait attention je ne sais pas d'ou proviennent tes ARNm, mais il n'y a pas que l'ORF sur les ARNm il y a aussi des régions 5' et 3' non codantes qui peuvent etre assez grandes. connais tu le +1 de transcription de ton ARN?

Yoyo

[invite2936c094]

Bonjour,

Je ne connais pas mon point +1 de transcription mais lors des tests PCR directement sur ARN, les primers se trouvent de part et d'autre du promoteur, je ne devrait, je suppose, donc pas amplifier cette partie là.

Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de "jauger" l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2936c094]

Bonjour,

Les essais ont révélés que la DNase du kit Machery Nagel ne fonctionnait pas assez sur colonne (amplification en PCR du plasmide ajouté pendant l'extraction d'ARN). Dans la notice de cette DNase il est précisé qu'en cas de grosse quantité d'ADN, il faut utiliser la DNase après colonne puis réaliser un clean up.
Les tests ont été refaits en ajoutant la DNase après la purification d'ARN et un clean up a été fait.
Il y a toujours amplification.
La quantité de DNase a été multipliée par 3 mais encore une fois, il y a amplification!!!
Que me conseillez vous de faire?
Augmenter la quantité de DNase ou changer directement de DNase?

Merci pour vos réponses.

[piwi]

Après votre PCR, procédez à une digestion enzymatique de vos produits par l'enzyme de restriction DpnI. L'intérêt est que cette enzyme coupe un site de 4pb (donc très fréquent) uniquement quand celui ci est methylé. Du coup vous coupez le plasmide qui a été méthylé lors de sa production en bactérie mais pas vos produits PCR.
Une fois que vous avez fait cela, un petit clean up et c'est réglé.

Cordialement,
piwi

[inviteb94d8e21]

Bonjour,

Tu sembles avoir deux problèmes distincts (en supposant que tes conditions de digestion par la DNAse sont correctes) :
1/ Tu es encore contaminé par de l'ADN, ce qui explique l'amplification après un traitement RNAse (mais sans traitement DNAse).

2/ Il y a un second promoteur en amont du promoteur que tu connais et, du coup, il y a un transcrit qui contient la séquence de ton promoteur. Ca arrive fréquemment. Ca expliquerait pourquoi tu amplifies un fragment malgré le traitement RNAse (sans DNAse).

Je ne pense pas que digérér par DpnI après l'amplification soit utile dans la mesure ou il s'agit d'une RT PCR, possiblement contaminée par de l'ADN génomique, et non de l'amplification d'un ADN venant d'une bactérie. Ceci dit, si tu soupçonnes un problème de DNAse, tu peux prédigérer tes échantillons par une enzyme de restriction (avant de faire la PCR). Dans la mesure où tu connais la séquence de ce que tu amplifies, tu peux même choisir l'enzyme pour être sûr qu'il y a un site (ou mieux, plusieurs) dans ta séquence cible.