Manip de co-IP??? what's wrong!!!

[invited5a089b3]

bonjour tout le monde,
je m'adresse à vous parce que j'ai un soucie au niveau de ma thèse concernant la manip de co-IP. En fait, j'immunoprécipite ma protéine qui taguée V5 par l'Ac anti V5 grâce au système de protéine G sépharose. une fois c'est fait, après le WB je révèle la protéine Topoisomérase 2 alpha. ce qui me contrarie c'est que je révèle cette enzyme aussi bien des culots d'IP d'intérêt que dans le contrôle négatif. J'ai refait la manip au moins 5 fois et c'est tj le même résultat. D'après vous, comment vous expliquez cela!!! sachant que mon lysat cellulaire totale est toujours traité par la benzonase (pour dégrader l'ADN).
La seule explication que j'ai c'est l'ADN est tombe aussi dans le culot par affinité avec les billes d'agarose et que comme la topo 2 est une protéine se fixant à l'ADN ça pourrait expliquer le fait qu'elle soit présente au niveau du contrôle négatif.
Merci d'avance
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[gorben]

Salut,

Ton Ac II du WB ne cross-reagirait pas avec ton Ac d'IP par hasard?
Si oui, c'est normal que tu ais quelque chose dans ton controle negatif.

A+

[LXR]

Il y a autre chose qui pourrait expliquer le problème : satures-tu tes billes protéine G sépharose avec de la BSA? Certaines protéines se fixent sur la sépharose et/ou sur les protéines G. Une étape de saturation peut donc s'avérer nécessaire pour masquer les sites potentiels d'interaction non spécifique.

Une dernière chose : si après avoir testé toutes les étapes tu t'aperçois que tu as toujours ta protéine d'intérêt, il est possible que l'anticorps anti-tag reconnaisse la protéine endogène i.e. celle qui n'est pas taguée. Cela est très rare mais ça m'est déjà arrivé!

Greg

[invited5a089b3]

En fait, je crois qu'on peut incriminer tout (l'Ac, les billes le tag...), je voudrais juste attirer votre attention à un détail. C'est que j'ai réalisé dernièrement deux manip d'IP anti V5, la première avec la protéine A j'avais un lysat cellulaire totale (non transfecté par V5) et un autre transfecté V5, la deuxième manip d'IP réalisée avec la protéine G, idem. j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir!!!
Des réflexions s'impose...................

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb94d8e21]

Bonjour,

Je pense que ta première explication est la bonne. Tu dois trainer de la chromatine insoluble que tu retrouves dans tes culots d'IP. Fais un préclearing de ton extrait (centrifugation à fond pendant au moins 15 minutes) avant d'incuber avec ton anticorps et tes billes.

[invited5a089b3]

C'est ce que je me suis dit moi aussi, je vais suivre votre conseil et voir ce que ça donne. Quelqu'un peut me proposer des kits d'IP fiables ou crédibles à part la protéine A/G?

[gorben]

En fait, je crois qu'on peut incriminer tout (l'Ac, les billes le tag...), je voudrais juste attirer votre attention à un détail. C'est que j'ai réalisé dernièrement deux manip d'IP anti V5, la première avec la protéine A j'avais un lysat cellulaire totale (non transfecté par V5) et un autre transfecté V5, la deuxième manip d'IP réalisée avec la protéine G, idem. j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir!!!
Des réflexions s'impose...................

C'est exactement ce qui arrive quand ton Ac secondaire (voire primaire mais c'est moins probable) de western blot reconnait ton Ac d'IP (antiV5). Lors de ton IP tu sature en antiV5, certains seront fixe a V5 d'autres seront libres. Lors de l'elution tu recuperes ta proteine V5, toutes celles qui sont accrochees avec ET ton antiV5 que tu fais migrer sur gel.

A+