Lysis buffer

[invitef08a311f]

Salut à vous,

J'ai commencé mon stage de master en bio il y a quelque mois et je suis actuellement en train de peaufiner mon protocole de western blot.
Mon buffer de lyse est à base de CSH (Tris 250mM, NaCl 1.25M et EDTA 5mM), le tout dilué 5x avant utilisation, on y ajoute du triton X-100 et un protéase cocktail inhibitor...
Je voulais savoir si il était envisageable de mettre le triton x-100 dans la solution 5x à l'avance sans en perturber l'efficacité, en effet lorsque je prépare mon buffer le triton est dilué 1000x --> un peu chiant à pipetter vous imaginez... 5ul d'un truc tout gluant c'est pas top top et pas précis du tout. Je pourrais toujours préparer plus de solution mais j'ai rarement besoin de plus de quelques centaines de ul alors voilà...


Merci d'avance et très bonne journée


BenCaliF
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[piwi]

En fait, il faut vous préparer un stock de triton 10% voir 5%. Ainsi vous ne pipettez pas pour la constitution de ce stock. Ensuite quand vous préparez votre buffer, vous pipettez de plus gros volumes d'une solution bien plus fluide.

Cordialement,
piwi

[Flyingbike]

Il est conseillé de mettre le triton X-100 au dernier moment. Pour faciliter le pipetage, il faut couper l'extremité du cone pour élargir le trou, aspirer, puis essuyer l'extérieur du cone avant d'ejecter.

Quant à préparer des solutions diluées, je pense que c'est compliqué, ça augmente le volume apporté qui doit donc etre pris en compte dans la dilution des autres produits...

Pour info quand je fais des protéines je mets 1% triton et pas 0,1%

[gorben]

Salut,

Pourquoi mettre le triton au dernier moment? Perso je prepare mes tampons de lyse en 1x avec le detergeant. La seule chose a ajouter plus tard est le coktail de protease inhibitor.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

+1.

Pareil pour moi. Le triton étant un détergent, pas de problème de conservation. A la limite, on ne met pas les détergents dans les solutions stocks sur-concentrées (5X, 10X,...) à cause de problème de solubilisation.

Greg

[invitef08a311f]

De la bombe.
Ca fait longtemps que j'ai fait ce post et j'ai réglé tout ça depuis un moment maintenant (J'ai même eu le temps de partir en vacance pour dire...).

Merci pour tout ces tuyaux en tout cas.

Très bonne journée à tous.
BB