Design primers

[invite207e170b]

Bonjour,
J’ai absolument besoin de votre aide. Voilà, je souhaiterai amplifier par qPCR un produit de reverse transcription qui provient d’ARN extrait d’un tissu fixé en paraffine. Dans ces cas là, les ARNs sont très dégradés, donc plus courts, aux environs de 100 pb. J’aimerai savoir comment designer mes primers dans ce cas précis? quelle taille doivent-ils faire, sachant que des primers normaux font environ 20 nucléotides, j’imagine que je dois les faire plus courts. Quelle taille doit-je donner à mes amplicons ? En résumé, comment amplifier une séquence provenant d’ARN très dégradé ? Merci beaucoup de votre aide.
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[Flyingbike]

tu es sure qu'ils sont dégradés à ce point ? je n'ai jamais travaillé sur des arn de paraffine. As tu vérifié leur état en les déposant sur un gel d'agarose 1% par exemple afin de voir l'état du 18 et 28S ?

Pour les primers, diminuer leur longueur diminue aussi la spécificité comme tu peux t'en douter. Je crains que si tu essaie d'amplifier en PCRq tes ARN tu n'aies pas un produit a taille unique...