ARN insoluble ??

[Flyingbike]

Bonjour,

Je suis vraiment à court d'idées. Voila le problème :

J'ai fait une extraction d'ARN d'hépatocytes en culture primaire en utilisant du RNA plus (équivalent du TRizol).
Au moment de reprendre mes ARN dans l'eau, ceux issus des hépatocytes transfectés (Adénovirus et siRNA avec un transfectant, le "PEI") restent totalement insolubles dans l'eau, alors que les autres sont repassés en solution aisément.

Je n'ai pas d'idée pour y remédier. J'ai deja testé :

bain marie à 65
relavage à l'éthanol
dosage des ARN dans l'eau (rien, a part une absorbance à 230nm, je ne sais pas a quoi cela correspond)

Qu'est ce qui pourrait interférer avec la dissolution des ARN ?

merci d'avance
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[invite6487dc7f]

Tu as bien séché tes ARN avant des les dissourdre?

[Flyingbike]

autant que ceux qui se sont resolubilisés rapidement...

[invite6487dc7f]

Et en terme de quantité, à l'oeil il n'y a pas de différence?
Si c'est la cas, je ne vois pas de raison ni de solution à ton problème, dsl.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

aucune différence.... Je sèche totalement...

[invite6487dc7f]

T'as un contrôle NT j'imagine, il lui arrive quoi a lui?
Ca vient peut être du PEI, fait un essai juste avec du PEI en plus voir si ça vient de là. Si c'est le cas tu peux trouver un moyen de l'éliminer ou changer ton mode de transfection.

[Flyingbike]

les ARN de cellules non transfectées se resuspendent bien. Le problème c'est que pour transformer des hépatocytes, c'est la seule solution. Mais le PEI a été évacué en changeant le milieu, et il y a eu un lavage avant extraction...

merci de ton aide en tout ccas

[invite6487dc7f]

Ya pas de quoi, mais c'est quand même bizar ton histoire.
Tous les essais transfectés ont ce problème? peut importe ce que tu transfecte?

[Flyingbike]

Ya pas de quoi, mais c'est quand même bizar ton histoire.
Tous les essais transfectés ont ce problème? peut importe ce que tu transfecte?

absolument. Je n'arrive pas a concevoir qu'un élément présent lors de la transfection, meme apres changement du milieu et lavage, persiste au point d'empecher les ARN de se remettre en solution...

[invite6487dc7f]

Ba si ton PEI reste à l'intérieur de tes cellules, il est libéré lors de la lyse, et pour une raison ou pour une autre reste attaché à tes RNA (surtout si il les précipite) ca pourrait être à peu près plausible.
Ce serait étonnant qu'un produit qui précipite les RNA soit utilisé comme transfectant et que tu sois le seul a avoir ce genre de problème.
Trouve quelqu'un qui se trouve dans le même cas que toi (purifie les RNA après cette technique de transfection) et demande lui si il a des problèmes similaires.
Après ça, si tu es le seul dans ce cas, je n'ai plus d'idée...lol

[Flyingbike]

Bon, je déterre, mais j'ai toujours le même problème. Si quelqu'un à une autre idée...

[kamor]

Perso je testerai le PEI comme décrit plus haut

[Flyingbike]

j'ai dejà essayé, le problème vient justement du PEI...

[kamor]

On peut supposer dans ce cas que ton PEI doit se fixer aux ARN de façon forte et que le couple ainsi formé doit être insoluble.
Donc soit ta molécule a un problème, soit faut trouver une façon de les séparer.

[gorben]

Salut,

Je confirme, le PEI c'est chiant !

J'ai eu de gros problemes avec le PEI recemment (pas avec de l'ARN mais avec de l'ADN). Impossible de resuspendre les culots puisque le PEI precipite les molecules negatives et donc precipite l'ADN (dans ton cas l'ARN).
Cherches sur pubmed des articles de Burgess RR. Il y en a un (dans les annees (80-90) ou il decrit pas mal les proprietes du PEI (ou polymin P). C'est un J. enzymol. il me semble.

Grosso modo ce qui est a retenir c'est que le PEI precipite tout ce qui est negatif (proteine, ADN et potentiellement ARN). A 1M NaCl seul l'ADN (et peut etre l'ARN) reste encore fixe au PEI. A 1.4M NaCl l'ADN se decroche...
Je te conseille donc d'essayer differentes concentrations de NaCl dans ton tampon de resuspension. Le probleme c'est que tu vas te trainer du PEI jusqu'a la fin puisque si tu dialyses il va immediatement de refixer sur ton ARN. Eventuellement l'utilisation d'un kit de purif d'ARN pourrait aider (avec des colonnes).

Bonne chance
A+

PS : le plus simple serait de changer de methode de transfection si c'est possible.

[noir_ecaille]

Si c'est une question de molécules positives/négatives.

Je suis béotienne. Néanmoins j'ai une petite suggestion :
- ressolubiliser l'ARN avec une solution saturée en NaCL,
- effectuer une séparation sur colonne de résine en phase liquide,
- purifier/laver les solutions d'ARN du NaCl (précipitation au méthanol je crois, centrifugation, etc.).

Bien sûr j'ignore complètement ce qu'est ce fameux PEI, s'il a le même point moléculaire que votre ARN, etc..

Cordialement.

[Flyingbike]

Très bonnes idées ici, je pensais a un truc du genre. Je comptais aussi essayer avec de l'acétate de sodium. Ce truc est chiantissime... Le problème pour la méthode de transfection, c'est que c'est à ma conaissance la seule technique qui fonctionne sur des hépatocytes. Je vais jeter un oeil a cet article, mais je croyais avoir tout lu sur le PEI (dans le désespoir...)
Merci a tous, je vous tiens au courant

[Flyingbike]

Les nouvelles : Acétate de Na, aucun effet. NaCl 1,5M, pareil. Maintenant j'essaie de repasser mon culot dans du phénol/chloroforme, mais si le culot se dissout bien dans le phénol, il se reforme dans la phase aqueuse lorsque j'ajoute le chloroforme... Une histoire de fou !

[kamor]

Donc le PEI resterait en solution dans le phénol... Là va te falloir des biochimistes. Ou arrête le chloroforme
J'ai trouvé ça vite fait, pas eu le temps de lire en détail, mais ils ont l'air de parler de la condensation de l'ADN par le PEI, t'auras peut être des pistes
http://www.nature.com/gt/journal/v6/.../3300976a.html
http://hal.archives-ouvertes.fr/docs...e_Menneson.pdf
http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:...e_ArnoldAS.pdf

[gorben]

Bizarre que tu n'ais rien avec le NaCl 1.5M es tu sur de ne rien resuspendre? Quand je l'avais fait, mon culot etait dur a resuspendre, mais en forcant je voyais quand meme que quelque chose se passait. As tu dose tes ARNs apres 1.5M de NaCl?
Peut etre que l'ARN necessite une concentration de NaCl plus importante (2M ?)

Bon courage.

[Flyingbike]

j'ai dosé mon surnageant, autant dire que c'est de la flotte. LE problème est que pour se débarasser de ce NaCl, il va falloir y aller. Je tente une réextraction, j'ai réussi a reprécipiter quelque chose, reste a voir si c'est plus soluble qu'avant.

kamor, merci pour les liens. Ce qu'on y lit c'est que le PEI condense effectivement les acides nucléiques. Le problème c'est que tous les gens qui l'utilisent n'extraient pas d'ARN ensuite (protéines, luciferase assay, microscopie, etc...)

[Flyingbike]

Bon, apres réextraction phénol/chloroforme, le culot reformé n'est toujours pas soluble...

[kamor]

Désolé flyingbike, j'avais rapidement cherché à en savoir plus sur cette molécule, je connaissais pas avant.
Mais ça crée quel type de liaison avec l'ARN ?

[Flyingbike]

c'est un gros polymère cationique, je pense que ca crée des liaisons ioniques. Mais difficiles à déplacer...

[noir_ecaille]

Tant qu'à faire, autant mettre du NaCl jusqu'à saturation (le sel cesse de se dissoudre dans l'eau). Je ne vois que ça pour forcer l'ARN à se décrocher.

Est-ce qu'on pourrait, avec une telle solution ionique, jouer sur le pH pour que l'ARN se charge positivement ?

[Flyingbike]

oui mais après ? Comment déssaler sans reprécipiter le tout ?

En fait j'ai remis mon "insoluble" dans du phénol chloroforme (genre trizol), le culot s'est dissous semble-t-il. J'ai récupéré le surnageant aqueux, ajouté de l'isoprop pour précipiter l'ARN, et ben ça m'a redonné un culot insoluble !

[gorben]

oui mais après ? Comment déssaler sans reprécipiter le tout ?

En fait j'ai remis mon "insoluble" dans du phénol chloroforme (genre trizol), le culot s'est dissous semble-t-il. J'ai récupéré le surnageant aqueux, ajouté de l'isoprop pour précipiter l'ARN, et ben ça m'a redonné un culot insoluble !

ca c'est normal vu que tu te gardes le PEI. Lorsque les conditions redeviennent favorables ([sel] dimunue par exemple) il va se refixer sur tes acides nucleiques. Pour moi la seule a faire et de le dissocier NaCl (2 / 5M) puis de passer tes extraits sur une colonne de purif ARN. En theorie tes ARN negatifs vont se fixer et tu vas pouvoir les laver (normalement le PEI va soit passer sans se fixer, soit ne pas penetrer dans la resine)
Apres peut etre que 5M de NaCl ca interfere sur la fixation des ARNs sur la resine. Pour savoir il faut donner un coup de fil au service technique
Ce qui est sur, c'est que si tu veux des ARNs pour faire de la qPCR ou une microarray, ca sera pas quantitatifs avec tout ca.

a+