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Preparation et analyse de plasmides



  1. #1
    Alglin

    Preparation et analyse de plasmides

    Bonjour,
    J'ai effectué un TP de biologie où on a fait une preparation et un analyse de plasmide avec QIAprep. Malheureusement, je suis debutant en biologie et je n'ai pas tout compris de ce que j'avais fait.
    J'ai donc quelques questions:
    Apres avoir recupéré les bacteries, un des etapes du protocole etait :
    ressuspendre la solution avec un chelateur d'ions dissolvant, je ne comrpends pas du tout le terme ressuspendre. Un chelateur d'ion dissolvant est ce une sorte de pince biologique ?
    Apres on a utiliser les des enzymes de restriction HINd3 et ECOR1, si j'ai bien compris ces enzymes vont decouper l'ADN plasmidique en plusieurs parties, je me trompe ?
    Et dans l'analyse par electrophorese, en fait, plus les marques sont en bas plus l'Adn va etre peut condensé ?
    Je m'excuse pour toutes ces questions peu precises, en vrac et peut etre tres naives, mais c'est la premiere fois que je fais de la biologie et je suis donc un peu perdu
    Merci d'avance et bonne soirée.

    -----


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  3. #2
    MaliciaR

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Salut et bienvenu

    Quelle est ta formation initiale ? Physique?

    * resuspendre les bactéries : normalement, tu récupères la culture bactérienne (le truc d'une couleur douteuse qui sent pas bon) et tu mets 1.5 ml dans un pitit tube, puis tu centrifuges. Il se forme un culot (un agrégat de bactos au fond du tube) et le surnageant est jeté. Ca sert à ne garder que les bactéries, pas le milieu (=le liquide nutritif) où elles ont poussé. Mais la question est comment les décoller du fond du pitit tube? C'est là qu'on dit "on resuspend" : on ajoute une solution spéciale (ton chélateur) et on essaye de mélanger l'agregat avec.
    Je n'ai pas compris de quelle pince biologique tu parles par contre...

    * Les enzymes que tu cites, HindIII et EcoRI, sont appelées enzymes de restriction. Elles vont reconnaître des endroits particuliers au sein de l'ADN : des sites de restriction (des séquences palindromes, il y a une discussion dessus, si je ne m'abuse, donc regarde ). Ces sites sont connus à l'avance (= on sait donc où ils se trouvent et quelle enzyme les reconnaîtra spécifiquement). Comme tu te doutes, HindIII et EcoRI ne reconnaissent pas les mêmes sites. Donc, en fonction des enzymes que tu utiliseras, tu découperas ton plasmide en morceaux de tailles différentes.

    * Dans l'analyse par électrophorèse, tu vois des choses différentes en fonction de la conformation de ton ADN. Ainsi, dans le cas simple où on utilise de l'ADN linéaire (ton plasmide en morceaux après la digestion par les enzymes de restriction), plus "c'est bas", plus c'est petit. C'est ton marqueur de poids moléculaires qui t'informe de ça : classiquement, la bande la plus basse est dans les 300 pb (je crois ).

    Hope that helps.

    N'hésite pas si tu as d'autres questions
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  4. #3
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Wow merci, ce que tu m'as expliqué est tres clair, enfin pour l'instant.
    Non ma formation initiale n'est pas la physique mais les mathematiques et l'informatique. Je debute un master de bioinformatique, c'est pour ca que la biologie est toute neuve pour moi.
    Merci beaucoup en tous cas, je risque de vous reposer des questions demain !

  5. #4
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Oui alors pour l'histoire des chelateurs, je citerais wikipedia:
    La chélation (prononcer kélassion, du grec khêlê : « pince ») est un processus physico-chimique au cours duquel est formé un complexe, le chélate, entre un ligand, dit chélateur (ou chélatant), et un cation (ou atome) métallique, alors complexé, dit chélaté.

    Le « chélate » se distingue du simple « complexe » par le fait que le cation métallique est fixé au chélateur par au moins deux liaisons de coordination définissant un cycle avec le métal, à la manière d'une pince, d'où le nom.

  6. #5
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Oui pardon, j'enchaine les postes pour pas grand choses.
    Dans notre TP, on a fait deux gels avant et apres digestion....Digestion ?
    Laissez digerer, ca veut dire attendre que nos enzymes aient fait completement effet ?
    Merci encore pour vos probables reponses
    et bonne journée

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    avant digestion, ton plasmide est entier (et circulaire)
    après digestion, il est en fragments (dépendant du nombre de sites reconnaissables par les enzymes de restriction)

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  10. #7
    MaliciaR

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Héhé, j'ai fait l'inverse que toi : passer de la bio à l'info
    Donc, pour chélateur, regarde l'histoire d'hémoglobine : tu as un atome de fer "épinglé" entre 4 liaisons C'est un peu ça, en fait. Pour la soupe biochimique, je n'ai pas le courage ce soir, désolée...
    Sinon, la digestion c'est quand tu mets ton enzyme dans le mélange réactionnel et que tu attends un pitit moment pour qu'elle agisse (faut-il qu'elle parcoure la chaîne de caractères et trouver la regexp qui match quoi). Il faut donc que d'une façon ou d'une autre, on teste le succès de la chose : donc, avant digestion, on regarde la tête de l'ADN *non digéré* sur gel. Après digestion, on compare : si notre ADN a la même tête, c'est FAIL; si on a des bandes qui correspondent à ce qu'on a calculé d'après les positions des sites de restrictions (les regexp), c'est PASS.

    Hope that helps
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  11. #8
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Haha c'est marrant !
    En fait, on a fait notre electrophorese sur plusieurs especes de E.coli, HRPN PGAG PCK3 et PLTR avec ECOR1 et HINDIII, une autre chose que je n'ai pas comprise, c'est : Est ce que c'est enzymes de restriction vont séparer les plasmides avec le même nombre de fragments ? A priori non. Mais MaliciaR, tu as insinué que l'on pouvait calculer avant operation le nombre de fragments ? Ca se fait avec la carte circulaire c'est ca ?

  12. #9
    Keitaro44

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Le nombre de fragments dépend du nombre de site de restriction qu'il y a sur ton plasmide. S'il y a deux sites, tu auras 2 fragments linéaires, 3 sites 3 fragments etc. Le truc c'est que tu auras forcément un mélange des formes non digérées et des formes digérées (voir des formes partiellement digérées). Sur l'électrophorèse, il ne faut donc pas t'étonner s'il y a des bandes (normalement elles sont peu visibles vu qu'il n'y en a pas beaucoup) à la même hauteur que ton témoin sans digestion.
    La carte circulaire comme tu dis (= la carte de restriction) se fait après l'électrophorèse. Tu ne peux pas prédire le nombre de fragments que tu auras (à part si tu connais la séquence complète de ton plasmide).

  13. #10
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Ok ok merci

  14. #11
    MaliciaR

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Citation Envoyé par Keitaro44 Voir le message
    Tu ne peux pas prédire le nombre de fragments que tu auras (à part si tu connais la séquence complète de ton plasmide).
    Il la connaît, je crois.

    Citation Envoyé par Alglin
    Est ce que c'est enzymes de restriction vont séparer les plasmides avec le même nombre de fragments ?
    Je n'ai pas compris cette question. Tu la refais en clair?
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  15. #12
    Alglin

    Re : Preparation et analyse de plasmides

    Oui pardon,
    est ce que les enzymes de restriction vont decouper les plasmides de HRPN, PGAG, etc... de la meme facon ? Mais je ne pense pas en fait avec ce que vous m'avez expliqué avant, ca depend de la carte de restriction.Elles sont trouvables sur internet ces fameuses cartes ? Il parait qu'on connait parfaitement E.coli aujourd'hui.

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