élution protéine

[invited40409d0]

Bonjour,
En TP, j'ai utilisé une colonne séphadex G100 pour purifier une phénoloxydase végétale. La courbe d'élution (concentration protéine fraction = f(volume élution))présente un premier gros pic (je pense qu'il représente les grosses molécules) puis un deuxième pic plus petit (qui représente les molécules de plus petites tailles). En parallèle de cette courbe il me faut tracer la courbe d'élution de l'enzyme (Activité fraction = f(volume élution))après avoir mesuré l'activité des fractions au spectro.
Le problème c'est que j'obtiens deux pics pour l'enzyme (un gros et un petit) alors que je ne devrais en avoir qu'un seul (qui représenterait les fractions contenant la phénoloxydase).
A quoi cela pourrait être du ?

Merci d'avance pour vos réponses.
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[invite71f23525]

Bonjour,

Etant donné que tu mesures une activité après ta chromatographie, elle doit très certainement se faire en condition native. Je suppose que tu détectes l'activité phénoloxydase dans les deux pics? Lorsque tu détermines l'activité spécifique de chacun des pics, qu'obtiens-tu? As-tu à disposition une courbe d'étallonage pour cette colonne qui te permettes d'évaluer grossièrement les tailles des protéines en fonction de leur volume d'élution?

En attendant, on peut envisager :

- Une part de ton enzyme est sous forme libre, une autre part est liée avec une autre protéine.
- Ton enzyme se multimérise (di-, tri-, tétramère,...).
- Tu élues deux protéines différentes ayant chacune une activité phénoloxydase.

Pour résoudre les deux premiers points, une augmentation de la force ionique peut tendre vers un profil d'élution à un seul pic. Cependant à gérer avec prudence puisqu'une concentration en sel trop forte peut dénaturer l'enzyme, ou inhiber son activité enzymatique ce qui entrave le but recherché.

Pour savoir si tu as deux protéines différentes (troisièmepoint énoncé), tu prélèves un échantillon de chacune de tes fractions. Tu le dénatures puis tu le fait migrer sur un gel SDS-PAGE (donc condition dénaturante). Soit tu révèle en bleu de comassie, avec l'indication de taille tu pourras déjà suspecter d'avoir la même protéine ou non. Soit tu fais un western blot avec un anticorps dirigé contre ta protéine d'intérêt. Cela ne te permettra pas de tirer une conclusion définitive mais d'avoir une idée sur la nature des pics. Pour avoir une conclusion quasi-définitive, tu analyses tes échantillons par spectrométrie de masse (ESI-MS douce pour une indication de masse, MS-MS pour une définition de la séquence peptidique).

Greg

[invited40409d0]

Merci pour la réponse, j'ai l'activité de la phénoloxydase dans les deux pics mais ma prof m'a dit que je devais en avoir que dans un. Je ne savais pas à quoi ce la était du. Pour ce qui est du reste, je n'ai pas de courbe étalon pour trouver la taille des protéines mais j'ai pu calculer l'activité spécifique des pics. Pour le premier j'ai 0,12 U/mg et pour le deuxième 0,81U/mg mais je ne vois pas comment exploiter ces valeurs ...

[invite71f23525]

Est-ce que vous êtes tous partis du même produit pour la purification sur chromato ou avez-vous préparé chacun vos échantillons à purifier?

Si la prof dit qu'il devait y avoir qu'un seul pic, c'est que le problème est dû à la manip. Est-que la prof t'a au moins dit lequel des deux pics tu aurait dû obtenir? Cela nous permettra de savoir quel est le pic qui pose problème, et d'en tirer des conclusions.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited40409d0]

On fait les tp à tour de rôle (6 binômes pour 6 tp) et chacun doit apporter de l'écorce de chêne pour en extraire la phénoloxydase quand c'est son tour de faire ce tp. Peut être que la branche que j'ai prise était particulière (j'ai toujours eu de la chance avec ça ...) Enfin merci beaucoup pour les explications, c'est plus clair que ceux du prof (qui n'est presque pas là pendant la séance de tp et quand il y a un problème sur une manip il faut pas compter sur lui pour le résoudre !!)

Bonne soirée

[invite71f23525]

Oui enfin le problème n'est pas résolu pour autant....

Ce à quoi je pensais :

- Le pic "contaminant" est celui qui sort le plus tôt : agrégat de ta protéine dû à sa dénaturation, aux conditions d'extraction,...

- Le pic "contaminant" est celui qui sort le plus tard : perte de protéines habituellement associées à ta protéine (peu probable), perte de la structure quaternaire de la protéine (tout ce qui concerne l'association et l'organisation en multimères) qui ne provoque pas de perte d'activité enzymatique.

A ce stade, ce ne sont que des spéculations car il manque beaucoup trop de renseignements pour pouvoir avancer.

Greg