Bonsoir,
Je ne comprends pas une expérience de mon cours. On cherche ici à identifier les gènes qui sont sous le contrôle de SigmaE[1].
Selon moi, ce qu'on fait c'est ceci:
- on cultive des souches MC4100 qui portent un plasmide rapporteur contenant lacZ sous le contrôle d'un promoteur SigmaE dépendant, dans un milieu contenant du lactose à 30°C pour sélectionner les souches LacZ+ qui ont bien intégré le plasmide.
- on place ces souches sur milieu McConkey à 43°C => les colonies rouges (LacZ+) sont celles qui expriment bien LacZ (normal, puisque SigmaE est activé à haute température, et lacZ est sous le contrôle d'un promoteur SigmaE dépendant).
- on transfère le plasmide de ces souches dans des souches qui sont RseA-[2] qu'on cultive sur milieu McConkey à 30°C => on sélectionne les colonies rouges qui sont celles dans lesquelles SigmaE est bien effectif.
- on transforme ces colonies avec p(RseA+) et on les cultive dans le même milieu qu'avant => on sélectionne les colonies blanches qui sont celles dans lesquelles SigmaE n'est pas actif.
Ensuite je ne comprends pas ce qu'on fait.
Vu que les images mettent toujours un peu de temps avant d'être affichées, je vous mets la suite:
- "pFZY[3] candidates hybridized with htrA rpoE rpoH[4] probes"
commentaire de la prof. => éliminer les promoteurs sous le contrôle de SigmaE déjà connu
- "120 plasmids retained, séquençage, 19 promoteurs distincts"
Voilà, j'ai l'impression globalement qu'à la fin on extrait les plasmides et on élimine d'office ceux qui contiennent les gènes dont on sait qu'ils sont sous le contrôle de SigmaE (économie d'argent, d'énergie, de temps) pour séquencer uniquement les plasmides qui contiennent les gènes potentiellement inconnus sous le contrôle de SigmaE.
[1] SigmaE permet la synthèse de gène de réponse à un stress (haute température par exemple)
[2] RseA séquestre SigmaE à faible température
[3] pFZY est le plasmide utilisé comme plasmide rapporteur qui contient lacZ
[4] rpoE et rpoH sont des gènes sous le contrôle de SigmaE (qui est enfait RpoE). htrA est sûrement un autre gène contrôlé par SigmaE (?)
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Une autre question:
A un moment donné dans le cours, on cherche à induire un stress pour étudier SigmaE.
J'ai marqué ceci:
"Comment induire un stress extracytoplasmique ? Ajout/Surproduction de porine (ex : OmpC) au niveau de la membrane externe de E.coli => accumulation d’ions dans le périplasme => stress extracytoplasmique."
Mais plus tard, on se rend compte que OmpC est un acteur de la signalisation du stress puisque son mauvais repliement active une protéases qui va cliver RseA qui va permettre la déséquestration de SigmaE et donc la synthèse de gènes de réponse au stress.
Comment le stress a donc été induit ? Peut être que les deux possibilités ne sont pas incompatibles ?
Merci de votre aide,
Cordialement.
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