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Carte de restriction



  1. #1
    JM2B

    Unhappy Carte de restriction

    Bonjour,

    Je sèche totalement sur la manière d'établir une carte de restriction d'après un résultat d'électrophorèse.
    On travaille sur une molécule d'ADN plasmidique circulaire double brin de 4361pb.
    La lecture de la plaque de gel d'agarose à l'UV donne:

    *Eco R1 : 2 bandes - 4000 et 8000 pb
    *Bam H1: 2 bandes - 4000 et 8000 pb
    *Hinc 2 : 2 bandes - 1100 et 3000 pb
    *Ecor1+Bamh1: 2 bandes - 380 et 4000pb
    *Ecor1+Hinc2: 3 bandes - 400, 600 et 3000 pb
    *Bamh1+Hinc2: 3 bandes - 250, 800 et 3000 pb

    Comment dois-je m'y prendre?

    Merci!

    -----


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  3. #2
    JM2B

    Exclamation Re : Carte de restriction

    Up? merci

  4. #3
    piwi

    Re : Carte de restriction

    Il doit y avoir un souci dans vos données. Normalement, l'ensemble des fragments produits pas une digestion doit vous reconstituer le plasmide natif. D'où vient le fragment de 8000 pb quand on parle d'un plasmide de 4300 pb?

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    JM2B

    Re : Carte de restriction

    Merci pour ton aide

    Au niveau de mon autoradiographie, je distingue pour les enzymes ECOR1 et BAMH1 2 bandes : une bien distincte à 4000pb et une trace à 8000pb.
    Peut-être que la marque à 8000 n'est qu'une trace dont il ne faut pas tenir compte.
    Je me base à la "graduation" donnée par un marqueur de taille Smartladder Eurogentec qui contient des fragments de 200 400 600 800 1000 1500 2000 2500 3000 4000 5000 6000 8000 10000. Je suis parti du fait que la marque "10000pb" est celle la plus proche des puits de dépot (ai-je bien fait?).

    Si ces éléments ne suffisent pas, je peux tenter de scanner et de poster une image de l'autoradiographie réalisée.

    Encore merci pour ta précieuse aide

  6. #5
    Flyingbike

    Re : Carte de restriction

    le meilleur moyen pour les marqueurs, c'est de partir du plus petit, ca évite d'en sauter un (sauf si un est deja sorti du gel...)
    En tout cas je suis totalement d'accord avec piwi, il y a un probleme.
    Si tu peux la scanner ca serait parfait

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    JM2B

    Re : Carte de restriction

    Voila un scan de la plaque
    Les dépots sont de gauche à droite : Marqueur / ADN non-digéré / Eco r1 / Bam h1 / Hinc 2 / Ecor1+Bamh1 / Ecor1+Hinc2 / Bamh1+Hinc2. J’ai signalé par les flêches rouges les marques qui se voient pas bien. Les autres données sont précisées dans mes posts.


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  10. #7
    JM2B

    Re : Carte de restriction

    (suite du post)
    Ma nouvelle reflexion est la suivante : on ne tient pas compte des dépôts à 8000 qui sont une fausse interprétation. On se retrouve ainsi avec au total, pour les 6 derniers dépôts : 4000 - 4000 - 4100 - 4380 - 4000 - 4050, et on ajuste ces nombres pour les amener à 4361.

    NB: Voir le tout premier post pour le détail de lecture
    Dernière modification par JM2B ; 29/11/2009 à 18h30.

  11. #8
    Flyingbike

    Re : Carte de restriction

    Une bande avec EcoRI et BamHI : un site de chaque enzyme
    Deux bandes avec HinCII : deux sites, deux bandes (~1200 et 3000)
    Deux bandes avec EcoRI + BamHI : 380 + le reste : le site EcoRI est a 380pb du site BamHI
    Trois bandes avec EcoRI + HinCII : 400 et 600 + le reste
    Trois bandes avec BamHI + HinCII : 250 et 800 + le reste

    je le vois comme ca (en circulaire)


    HinCII - 400bp - EcoRI - 380bp - BamHI - 250bp - HinCII - 3000bp

    si on coupe avec HinCII : un bout de (400+380+250) = 1030 + le reste (3000)
    si on coupe avec EcoRI + BamHI : 380 + 3850
    si on coupe avec EcoRI + HinCII : 400 + (380+250) = 630 + 3000
    si on coupe avec HinCII + BamHI : (400 + 380) = 780 + 250 + le reste

    ça a l'air de coller non ?

  12. #9
    JM2B

    Re : Carte de restriction

    1000 mercis!

  13. #10
    Flyingbike

    Re : Carte de restriction

    ça te parait correct ?

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