Marquage fluorescent d'une protéine

[Yoyo]

Bonsoir a tous,

Je cherche a réaliser une expérience en FRET pour observer les changements conformationnels qui se produisent dans ma protéine. Pour cela j'ai besoin de la marquer spécifiquement. Je sais que je peux le faire par l'intermédiaire des résidus cystéines, j'ai donc retiré toutes les cys de ma protéine, pour n'en remettre qu'une la ou je le souhaite.

Ma question est maintenant de savoir si certains d'entre vous connaissent des kits permettant de réaliser ce marquage dans un labo de biologie moléculaire.

Merci pour vos réponses.

Yoyo
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[gorben]

Salut,

Il y a une bonne revue sur les differents type de marquage proteique (perso j'ai un gros penchant pour les lanthanides, mais j'ai jamais eu l'occas de les utiliser).
Si je parle bien de la meme methode que toi, il ne faut pas une seule Cys pour le marquage, mais un motif specifique (12 AA) comprenant 4 cys (c'est ici). Tu trouvera les reactifs chez invitrogen mais c'est cher (~ $600 pour pas beaucoup de manip). Sinon tu peux les synthetiser mais il faut un peu de matos.

Meme si c'est pas ce que tu as demande, il y a aussi l'option de certaines proteines fluorescente qui sont bien mise au point pour le FRET (ici par exemple).

Maintenant, si tu as une methode pour marquer une proteine avec une seule cys, je suis prend l'info ca m'interesse

A+

[Zellus]

Salut,

Tu dois pouvoir trouver ton bonheur ici. Si ça t'intéresse il y aussi un lien pour les fluorophores que tu peux exciter avec des UV. Perso j'ai marqué des protéines sur des lysines pour de la microscopie à fluorescence avec des molécules d'Invitrogen aussi et c'est pas bien compliqué. Deux heures dans la glace et le tour est joué alors tout un labo de bio mol devrait suffire je pense.
A moins que ce soit plus compliqué pour des marquages sur des cystéines ...

[Yoyo]

Salut

Merci a vous deux pour vos liens et les infos. Je vais lire tout ca et je vous dirais ce que j'en pense.

Bonne journée
Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

Les autres méthodes d'étude de la conformation d'une protéine (anisotropie de fluorescence, dichroïsme circulaire, spectro de masse douce, digestion ménagée,...) ne sont pas satisfaisantes pour l'étude que tu veux faire? En effet la mutation d'un acide aminé quelconque pour étudier une conformation tridimensionnelle me parait moins adapté que d'autres méthodes ne touchant pas à la séquence primaire (mis à part les cas où on mute pour voir l'implication de l'acide aminé dans la conformation spatiale de la protéine, bien entendu). L'ajout d'un groupement de taille trop importante dans une région dense de la protéine pourra induire une gène stérique modifiant le repliement de la protéine...

Qu'en penses-tu? Quel serait l'idéal pour ton cas?

Pour les récepteurs nucléaires, les changements conformationnels induits par le ligand sont largement étudiés. Cependant, le but des méthodes employées est peut-être trop loin du but que tu recherches.
Certains utilisent des ligands fluorescents, de structure très proche du ligand naturel, grâce à l'indium. La structure du fluorophore était présentée sur le site d'Invitrogen mais il semblerait que ce ne soit plus divulgué. De ce que je me rappelle, l'indium était au milieu d'une structure le stabilisant, de type noyau porphyrique. Quatre azotes était impliqués dans sa stabilisation centrale. Le processus de fluorescence devait passer par une excitation de double liaisons, comme c'est le cas par exemple pour la chlorophylle chez les végétaux (sauf qu'ici émission de fluorescence). Voici les informations désormais disponibles.

Greg

[Yoyo]

Maintenant, si tu as une methode pour marquer une proteine avec une seule cys, je suis prend l'info ca m'interesse

A+

Apparement invitrogen propose des fluorophore qui réagissent spécifiquement avec les thiols, ce sont des dérivés maleimides. ici

Par contre je ne me rend pas vraiment compte si c'est efficace ou pas
Yoyo.

[vpharmaco]

J'en utilise en ce moment dans un test de criblage pour marquer le CoA qui est formé lors d'une reaction enzymatique. La reaction est assez rapide. Tu devrais trouver des exemples de marquages de proteine dans la litterature.
La sonde en elle-meme est environ 1000 plus reactive envers les thiols qu'envers les amines. Differents flurorophores peuvent etre utilisés (fluoresceine, coumarine...). La reaction est habituellement faite à pH=7-8. Au dessus, le maleimide s'hydrolyse rapidement.
Par contre, pas question d'introduire la moindre quantité de SDS dans ton tampon ! On le remplace en general par de la TCEP (ou si on est vraiment très pauvre, de l'acide ascorbique).

Par contre es tu sûr que les cysteines que tu as supprimées ne participaient pas au folding de la proteine (via des pont SS notamment) ? Supprimer toutes les Cys d'une prot, c'est violent ...

[Yoyo]

Merci pour vos remarques intéressantes.

Qu'en penses-tu? Quel serait l'idéal pour ton cas?

j'etudie un complexe protéique qui pénètre a l'interieur du ribosome, la complexité du ribosome complique singulierement l'expérience, d'autant l'objectif est de la réalisée en particule unique!

C'est vrai qu'il y a un risque que la fluorophore modifie la protéine, mais on va croiser les doigts, et puis je peux me permettre de tester plusieurs positions.

J'en utilise en ce moment dans un test de criblage pour marquer le CoA qui est formé lors d'une reaction enzymatique. La reaction est assez rapide. Tu devrais trouver des exemples de marquages de proteine dans la litterature.

Donc tu es content ? je n'ai pas trouvé de kit complet pour le marquage avec les maleidines. Tu as fait comment ?

On le remplace en general par de la TCEP (ou si on est vraiment très pauvre, de l'acide ascorbique).

tu peux me préciser le role du TCEP stp?

Par contre es tu sûr que les cysteines que tu as supprimées ne participaient pas au folding de la proteine (via des pont SS notamment) ? Supprimer toutes les Cys d'une prot, c'est violent ...

Oui je suis sur qu'il n'y a pas de pont SS, et heureusement il n'y a que 3 cystéines dans la protéine en question. Mais malheureusement il est probable qu'au moins une soit importante. De toute maniere je ne couperai pas a vérifier la fonctionnalité de ma protéine mutée.

YOyo

[vpharmaco]

Donc tu es content ? je n'ai pas trouvé de kit complet pour le marquage avec les maleidines. Tu as fait comment ?

"Le kit" est pas bien compliqué. Cela se limite à l'achat de la sonde (par ex chez Pierce : http://www.piercenet.com/products/br...3-410E23D78308). Pour ma part, j'utilise une sonde dérivée de coumarine (mais je ne connais plus le fournisseur ).
Après, on incube à 37°C dans un tampon de type phosphate ou Tris à pH=7.4. Je pense que dans le cadre du marquage d'une prot, il faudra a la fin éliminer la sonde qui n'a pas réagit (dialyse ou ultrafiltration par ex).
Dans mon test, on suit juste la formation de l'adduit Sonde-CoA par fluorescence. Le derivé de maleimide qui n'a pas encore réagit n'est pas fluorescent (du moins, très peu).

tu peux me préciser le role du TCEP stp?

Rq preliminaire: Mon clavier a fourché ! je ne voulais pas dire SDS dans mon premier message mais DTT !!!

En fait, la TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl) est utilisée comme agent reducteur à la place du DTT (qui à le facheux inconvenient d'étre un dithiol)

[Zellus]

Mon clavier a fourché !

Méchant clavier !

[vpharmaco]

Méchant clavier !

Ne l'accablons pas trop! Déjà qu'il semble atteint de dyslexie vu le nombre de fautes d'orthographe qu'il fait

Fin du HS

[Yoyo]

Merci pour tes précisions.
En effet, je compte me débarasser de l'exces de sonde par une gel filtration (G25) qui semble etre le mieux adapté pour cela.

Si certaines personnes ont utilisé d'autres protocoles n'hésitez pas a donner votre opinion.

YOyo

[vpharmaco]

Le protocole de chez Pierce :
http://www.google.fr/url?sa=t&source...XSlQkwHBR-OmCw

Cordialement

[Yoyo]

Salut

Super! merci beaucoup pour le protocole!

yoyo