Bonjour,
je suis un débutant dans le domaine de la biologie (étudiant de 2ème année en science de la vie).
Je suis en train de rédiger un rapport d'un travail pratique. J'ai quelques doutes sur ma compréhension de chaque étape des manipulations et techniques effectuées en laboratoire.
Pour commencer, voilà ce que nous avions à faire (ou qui a été fait à notre place). Les prélévements ont été réaliser chez des souris (C57black6, 1-2months), le but étant d'insérer des plasmides avec le gène de l'amylase2 (de la souris) chez des bactéries...
Blue part done before the lab by us; the black part you have to perform.
Wear gloves, protection glasses and lab coat.
1) Add 1ml ice-cold Trizol per 50mg tissue; keep samples permanently on ice;
Homogenize using a tissue homogenizer (Polytron, small tip, 30sec. pos. 6).
3) Shake vigorously by hand for 1 min and wait 5 min. Spin 15 min at full speed
at 4ºC, transfer clear supernatant into a new tube (1.5ml).
4) Add 200μl Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol per tube, shake vigorously by
hand for 15 sec, wait 3 min.
5) Spin 15 min at full speed at 4ºC. Transfer upper (aqueous) phase to a fresh
tube.
6) Add 500μl Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol to aqueous phase. Vortex, and
spin again15min at 4 ºC. Transfer upper phase to a fresh tube.
7) Repeat 6).
8) To the aqueous phase (250μl) add an equal volume of 70% EtOH, mix well
by pipetting.
9) Load onto RNeasy column.
10) Spin 15 sec at 10’000rpm at room temperature (RT).
11) Wash with 700μl RW1, spin 15 sec at 10’000rpm.
12) Use a new collection tube; wash with 500μl RPE, spin as in 10).
13) Wash a second time with 500μl RPE, spin as 10).
14) Spin 2min, 13’000rpm at RT
15) Elute RNA into a fresh tube with 50ul of water; spin 1 min 13’000rpm, put on
ice.
Je dois maintenant rédiger un rapport, mais je ne suis pas certain de ce que j'y dis. Je vais décortiquer le problème en plusieurs points, il devrait être plus simple d'y répondre par la suite
Trizol:
Que fait exactement cette solution ? D'après ma compréhension, elle est composée de :
1) guanidinium thiocyanate
2) phenol
3) chloroforme
4) d'un alcool assez hydrophile (isopropanol ou Isoamylalcohol dans ce cas)
Y a-t-il un agent responsable de détruire la membrane cellulaire ?
Le guanidinium thiocyanate sert à dénaturer les protéines (genre RNase, afin de ne pas dégrader l'ARN). Le SDS pourrait-il faire pareil ?
Les trois autres produits constituent un environnement constitué de deux phases, dont une aqueuse contenant l'ARN.
Phenol/Chloroform/ Isoamylalcohol:
D'après ma compréhension, cette combinaison sert à rendre plus pure la phase aqueuse, en d'éliminant un maximum d'ADN et protéine s'y trouvant encore. Est-ce tout ou y a-t-il un autre but ?
70% EtOH:
Après l'utilisation de trizol et la purification (point précédent),
nous ajoutons de l'ethanol à 70%, pour faire précipiter l'ARN sans faire précipiter les sels, dont nous voulons nous débarasser. Est-ce correct ?
RNeasy column
Je n'ai pas appris le fonctionnement de cette colonne. Est-ce qu'elle agit comme un filtre en fonction de la grosseur des molécules ou utilise-t-elle d'autres propriétés des molécules pour les trier ? D'après moi, elle enlève les petits ARN, qui ne figurent plus sur le bioanalyser après son utilisation.
Après avoir suivi la marche-à-suivre, nous avons analyser notre échantillon au Nanodrop et au bioanalyser...
Nanodrop:
La technique utilise l'absorbance de l'ARN, l'ADN et autre molécules à certaines longueurs d'onde ciblées... Que puis-je dire là-dessus ? Que pouvez-vous dire sur les ratios 260/280 et 260/230 ? Mon analyse me renseigne sur la concentration (en ARN), l'absorbance à 280 et 260 et les deux ratios. Pour indication, j'ai obtenu les résultats suivants:
260/280: 2.13
260/230: 2.03
Ces rations varient-ils entre de l'ARN pure et de l'ADN pure ?
Bioanalyser:
En bref, , il s'agit d'analyser l'ARN ribosomique afin de s'informer sur lintégrité de l'ARN messager (l'ARNr étant plus fragile que l'ARNm chez les eucaryotes). Savez-vous pourquoi on peut supposer cette hypothèse chez les eucaryotes mais pas chez les procaryotes ? Concernant la dégradation ... quelles en sont les effets (enfin, la dégradation, est-ce l'ARN qui est dégradé par les RNases ou est-ce du à la chaleur, un stress physique ou autre ?)
Voilà, c'est à peu près tout, pour le moment
Merci d'avoir lu tout ça, j'attends impatiamment vos réponses
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