Impossible de récuperer ma protéine GST-X

[invite6d2c9f03]

Bonjour à tous, c'est mon premier post.
Je suis à bout de solution....
je produit en Bl21 des protéines GST-X, la production a été mise au point et la protéine est bien exprimée. Lorsque je veux récuperer cette protéine, j'utilise un tampon de lyse contenant du lysosyme, Dnases ( avec MgSo4 et CaCl2) à de très forte concentration, il y a du triton, du chaps et une forte concentration en sels à 1M , tris-Hcl à pH8 mais je n'arrive en aucun cas à sortir ma protéine. Lorsque je mets mon tampon de lyse, j'incube toute la nuit à 4°C j'obtiens un leger changement de turbidité puis je sonique pour bien casser tout l'ADN qui pourrait gener mon extraction puis je centrifuge 40 min a 13000 mais lorsque je verifie au bleu de coomassie en passant par gel SDS-page ma protéine reste dans le culot. Après 2mois dessus j'en ai marre, je n'y arrive pas et que de très faible amélioration
Quelqu'un aurait une idée du pourquoi ma protéine reste dans le culot avec autant d'hardeur? Une grande histoire d'amour peut-etre?
Merci beaucoup par avance
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[wolfgangouille]

Et le X c'est quoi?

[invite01c0ee05]

Bonsoir,

je voulais savoir si tu avais penser à changer de protocole un broyage mécanique avec des billes dans les culots bactériens avec lysozyme et utilisé un résine glutathion_agarose et par la suite réalisé une compétition par gluthation reduit.

Cordialement,

yahya

[gorben]

Salut,

Pour moi ca peut venir de 3 choses :
- les cellules sont pas lysees. Pas besoin d'incuber tes cellules ON dans le tampon de lyse. Ca devrait aller plus vite que ca, en plus c'est pas top de garder des proteines si longtemps. Utilises un tampon tout bete Tris + lyzozyme a 37 deg 30' puis rajouter du SDS pour une concentration finale de 1%. Vortexer, incubation 10 min puis sonication. Ca devrait bien le faire. Sinon le mieux c'est de casser les cellules a la presse de French. C'est ce qui se fait de mieux pour la purif de prot.
- Ta proteine est en corps d'inclusion (car tu es sur que les cellules sont bien lysees). Ca c'est la galere. Essaie de reprendre ton culot dans du GuHCl 6M, centrifuger 20' puis faire migrer le culot et le sup. Si elle est dans le sup ca signifie que ta proteine est insoluble. Essaie de regarder au niveau de l'usage de codons, et de tester differentes temperatures d'induction etc...
- ta proteine est membranaire et elle part dans les membranes lors de la centri. La j'y connais rien, mais il parrait que c'est hyper chiant

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6d2c9f03]

Merci beaucoup pour vos réponses, je vais donc essayer les billes pour casser mécaniquement. Ensuite je testerais le test avec GuHCl 6M pour voir.
Je vous remercie, je vous tiendrais au courant.

[piwi]

La lyse cellulaire n'a pas besoin d'être faite dans un tampon compliqué (en plus, lyser en NaCl 1M me semble plutôt excessif)

Voilà la méthode qui m'a été confiée par des pro de la protéomique et que j'utilise.
tampon de lyse:
Tris 20mM pH= 7.65
NaCl 250 mM
EDTA 1mM
Triton x-100 0.05%

Pour 500 ml de culture induite, je reprends les bactéries dans 10 ml de cette solution, j'ajoute une demie pastille de PIC (Roche) et je congèle à -20°C. L'idée est que la congélation soit suffisamment lente pour permettre la formation de critaux de glace qui cassent les cellules.
Le lendemain je procède à la lyse proprement dite en décongelant les cellules à 37°C (je laisse une petit glaçon) et je recongèle immédiatement dans l'azote liquide. Je répète le cycle trois fois.
Enfin, sonication 3 x 2 minutes (entre chaque cycle je refroidis les prot dans l'azote sans toutefois les congeler).

Après cela, c'est réglé, les bactéries sont lysées proprement.

Cordialement,
piwi