Pull down GST

[invite9ede8c9d]

Bonjour,

j'essaye de produire une protéine en fusion avec la GST afin de faire des tests d'interaction pull-down avec des extraits cellulaires.
Je souhaite donc fixer ma protéine en fusion en GST sur une colonne pui ensuite faire passer mes différents extraits cellulaires afin de déterminer des éventuels partenaires de ma protéine.

J'ai quelque souci de production de la protéine, j'arrive en avoir mais à des quantités pas très élevée. Sauriez-vous combien il faut de proteine en fusion avec la GST sur les billes pour faire le test pull down ?

Merci
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[invite8c0cc995]

Personnellement j'utilisais environ 10-15µg de proteine de fusion GST (80kDa au total) couplées aux billes GST pour faire mes test d'intéractions.
Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble ? Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.

La quantité nécessaire dépend de plein de paramètres, dont le poids moléculaire de la protéine d'intérêt (plus son PM est petit, moins il y a en besoin, car plus il y a de mole/µg), la force d'intéraction avec le partenaire, du type de détection (western blot, autoradiographie)...

Bonne chance.

[invite9ede8c9d]

Ma protéine en fusion fait environ 95kDa... Les intéractions avec les partenaires on ne les connait pas car justement on essaye d'identifier des partenaires...