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Purification de protéine recombinante de faible PM



  1. #1
    hbich73

    Question Purification de protéine recombinante de faible PM

    Salut les amis,je suis doctorant dans un labo de recherche. En ce moment j’essaye de purifer une protéine recombinante taggué Histidine dans E.Coli (BL21). Ma protéine fait environ 7 Kda. Je n’arrive pas du tout à la produire. Je me demande si pour des protéines de cette taille, ce système est adéquat. Peut-être qu’il ne permet pas de produire ces petites prot ou peut être faut –i l ajuster spécifiquement les conditions de culture. Si quelqu'un a une expertise la dedans, je suis preneur de toute information. MERCI d'avance pour vôtre aide.

    -----


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  3. #2
    wolfgangouille

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    Ça m'intéresse. J'imagine que tu fais une chromatographie d'affinité pour la purifier? Quand tu dis que tu ne la produit pas tu veux dire quoi par là que la purif ne marche pas ou que tu n'a pas du tout de ta protéine?
    Renaud

  4. #3
    hbich73

    Arrow Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    Oui je fais une chromato d'affinité pour la purif (colonne Ni-NTa). En fait, je suis en ce moment même en train de faire un western blot sur mes échantillons lysat bactérien.... pour déterminer si ma prot est bien produite par mon systeme. Si c'est le cas alors mon probleme vien de ma façon de purifier. Sinon, c'est le systeme de production qui n'est pas bon.....

  5. #4
    LXR

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

    Normalement, faire un western afin de valider la production de la protéine dans le système d'expression est la première chose à faire. Cela peut éviter de gaspiller inutilement le matériel nécessaire à la purification de la protéine.

    On attend de tes nouvelles,

    Greg

  6. #5
    gorben

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    Salut,

    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    Normalement, faire un western afin de valider la production de la protéine dans le système d'expression est la première chose à faire. Cela peut éviter de gaspiller inutilement le matériel nécessaire à la purification de la protéine.
    Je ne suis pas tout a fait d'accord. Tu DOIS voir ta proteine en coomassie. Si tu ne la vois qu'en WB tu peux considerer que l'expression n'est de toute facon pas suffisante pour une purif alors il faut travailller les conditions d'induction, rien ne sert de depenser ton temps et ton energie en WB. Ce qu'il te faut faire c'est tester differentes conditions comme par exemple 18-25-30-37-42 deg C; 30-60-120-240-480 minutes d'induction; differentes concentrations d'inducteur; differents mileux pour l'induction, verifier qu'il n'y a pas de biais d'usage de codons; etc
    Ensuite tu prends un echantillon de chaque essais (tu normalizes le depot par OD), que tu lyses et deposes apres denaturation sur un gel SDS-PAGE (coomassie). Tu les compares avec la souche non-induite et tu dois voir une bande supplementaire. Si tu ne la vois il te faut changer tes conditions jusqu'a la voir. Ensuite tu pourras faire des gros batch et passer tes lysats sur Ni-NTA. Avant ca ne sert a rien. Eventuellement, le WB peut servir a aider a la localisation geographique de ta bande supplementaire, mais en aucun cas tu ne peux te baser sur un WB positif pour faire la purif.

    Il me semble que le his-tag est ce qui est le mieux pour les petites proteines. Tu peux toujours essayer de tagger autrement, une MBP ou GST peut aider.

    Bon courage
    A+

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    est tu deja sure de ta construction ?

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  10. #7
    Yoyo

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    salut

    Sinon je prefere le tag StrepII (8aa) qui permet la fixation tres spécifique a la strep-actin plutot que His6 qui donne beaucoup de bruit de fond.

    YOyo

  11. #8
    piwi

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    [His]6 n'est vraiment pas terrible c'est vrai, cependant, je ne pense pas que ce soit là la question.
    Si vous testez l'expression avec un coomassie ou un dérivé du coomassie, il est possible que vous ne voyez simplement pas la protéine qui est quand même minuscule. Or les petites protéines ne colorent pas très bien.
    Eventuellement faites un essai aux sels d'argents (un peu chiant au niveau du dosage, j'utilise 0.1µl [1µl d'une dilution au 1/10] pour éviter la saturation).

    Sinon pour le WB je rejoins totalement Gorben qui a parfaitement résumé la démarche. Le WB n'a pas vraiment sa place ici et de toute manière, il faut bien avoir à l'esprit que l'on n'a pas toujours l'anticorps top moumoutte sous la main.

    Bon courage,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    hbich73

    Re : Purification de protéine recombinante de faible PM

    SAlut les amis ! merci pour vos contributions !
    j'ai fait séquencer ma construction, il est nickel.
    D'accord avec gorben, pour le coomassie . Sur mon Blot (résultat d'hier) je vois un marquage de mon surnageant de lysat avec un anti HIS, même si il est un peu faible. NB : j'ai fait un blot un peu spéciale pour gagner du temp : j'ai spotter directement 10 µL de mes échantillons (Surnageant, culot, éluat, ctrl positif..) sur ma membrane. Puis j'ai balancé mes anticorps dessus. Je voulais juste voir si j'avais un signal significatif quelque part.
    je pense que mes conditions de cultures ne sont pas optimales pour cette purif, alors si en plus je prend en compte le fait que comme le rappel PIWI, ces ptites prot ne colorent pas très bien en coomassie.
    Je vais donc suivre les conseils de gorben et essayé de tester plusieurs conditions d'inductions.
    En fait je pensai qu'il existait peut être des conditions un peu standart pour purifier les prots recombinantes de cette taille (7 KDa). Mais je sais que chaque prot est différente et qu'il faut souvent tester plusieurs cdtions pour trouver la bonne. On ne sait jamais.....
    MERCI ENCORE !
    Je tente ça et je vous tiens au jus ! pour ceux que ça intéresse

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