Production protéine recombinante E.coli

[inviteec077029]

Bonjour,

J'ai fait une production cytoplasmique dans E.coli dans un volume de culture de 50 ml. J'ai ensuite solubilisé mes corps d'inclusions par un volume de 5 ml (urée+Bmercaptoethanol+Tris HCL).
J'ai purifiée sur colonne nickel et récuperée 1 ml de proteine pur.
Je réalise ensuite des dialyses successives pour eliminer imidazol BmC et urée et ensuite j'essaye de renaturé par du glutathion oxydé/réduit.
Aprés une première dialyse je dose ma quantité de protéines et j'ai une concentration de 2,5mg/ml ensuite à la dernière dialyse j'ai une concentration de 0,6mg/ml. J'observais des agrégats que j'ai éliminé par centri.

Voila mes questions:

Pourquoi la proteine s'agrége? c'est seulement cela qui explique la différence de concentration, la technique de dialyse est-elle efficace? sinon pourrais-je utiliser une autre technique comme la filtration?

Et SVP dites moi pour une bonne prod on obtient qu'elle ordre de concentration ?
c'est bien 0,6mg/ml pour une culture de 50 ml???

Je suis débutante en prod de protéines merci de m'aider
-----

[Jean-Luc P]

Pourquoi la proteine s'agrége? c'est seulement cela qui explique la différence de concentration, la technique de dialyse est-elle efficace? sinon pourrais-je utiliser une autre technique comme la filtration?

Ca arrive souvent, en particulier si tu as une certaine hydrophobicité.
Il faut soit moins dialyser, soit essayer de faire la dialyse plus lentement...

La filtration te donnera beaucoup de pertes.


Sinon ta concentration me semble plutôt pas mal.

[inviteec077029]

Merci pour ta réponse.

Je fais des dialyses progressives, pour eliminer 8 M urée je commence par dialyser contre un tampon à 4M puis à 2M puis 0M. Si je réalise directement une dialyse contre un tampon ne contenant pas d'urée peut être bien que sa serais trop brusque non tu pense pas?

Je te demande également juste un petit détail:

Qu'est ce que tu entends par une dialyse lente?

[invite4ff72fd5]

Pourquoi la proteine s'agrége?

JL a énoncé une raison principale, l'hydrophobicité de la proteine, tu as également l'absence de protéines chapperones normalement présente chez les eucaryotes qui aident à la protection de la protéine.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Jean-Luc P]

Qu'est ce que tu entends par une dialyse lente?

Ta manière de faire, en fait

Sinon pas d'autre idée que les remarques de Mantos...