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dégradation de protéine recombinante



  1. #1
    mimosa

    Question dégradation de protéine recombinante

    Bonjour à tous,
    Je rencontre actuellement un problème lors de l'expression et la purif d'une prot recombinante. j'utilise le vecteur d'esxpression pQE30 et je purifie sur colonne NI-NTA, mais voila lorsque que je charge le produit de ma purif sur gel SDS j'observe bien la protéine d'intérêt à la MM attendue mais également des bandes de MM plus basse. j'en ai déduis qu'il s'agit de formes de dégradation de la prot recombinante ou bien de prot contaminantes mais je sais pas trop comment les éliminer. je sais que l'on peut modofier les conditions de purif comme la concentration en imidazole du tampon de lavage... mais peut-on modifier les conditions de culture est-ce que ça servirai à qq chose sachant que la prot est soluble.
    Merci pour vos réponses je débute dans le domaine des prot recombinantes (que du bonheur! ).

    -----


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  3. #2
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    D'après ce que tu dis, le plus probable est que ta protéine soit partiellement dégradée par des protéases contaminantes. Dans le cas où ta protéine d'intérêt n'est pas une protéase, la meilleure chose à faire est de détruire ces protéases en ajoutant 2 mM de PMSF et 2 mM d'EDTA. Pas de chance, tu travailles en colonne de nickel et l'EDTA est incompatible (et accessoirement, l'EDTA est en général l'anti-protéase-contaminante le plus important).

    Donc si tu travailles sur autre chose qu'une protéase, tu fais ta purification aussi vite que possible, à 4° si possible. Une fois que la protéine est produite, puis tu la purifies immédiatement, tu supprimes tous les temps morts et tu essaies de réduire les temps de lavage si ils sont excessivement longs. En sortie de colonne de Ni, tu rajoutes l'EDTA, ça détruit toutes les traces de protéase et tu peux souffler.
    Si tu travailles sur une protéase, c'est plus coton parce qu'il faut utiliser des inhibiteurs réversibles et qu'il en faut beaucoup plus. Par exemple : chymostatine + leupeptine + antipaine + pepstatine + aprotinine.
    Dans les deux cas, il faudra rajouter une colonne en fin de purif pour éliminer les contaminants. Une gel-filtration est probablment le plus simple, une échangeuse d'anion ou de cation peut aussi être une solution

    Voilà, bon courage !

  4. #3
    mimosa

    Re : dégradation de protéine recombinante

    merci beaucoup pour ton aide! ma prot n'est pas une protéase se sera donc plus facile mais effectivement je n'enchaine pas vraiment les manips le plus vite possible. par contre j'utilise 1mM de PMSF que je rajoute juste avant la lyse bactérienne et je travaille dans la glace.

  5. #4
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Ca devrait ameliorer pas mal les choses, je pense. Le PMSF, c'est une bonne chose, ça permet d'éliminer toutes les sérines-protéases (comme la trypsine). L'EDTA à la fin est important aussi, il élimine les métallo-protéases qui sont présentes en masse dans beaucoup de systèmes d'expression, notamment en bactéries il me semble.
    Pour la quantité d'EDTA à mettre, ça peut être un peu tordu. Disons qu'il faudra faire attention si ta protéine contient des cations divalents, elle pourrait ne pas trop apprécier le traitement (mais ça peut très bien se passer aussi). Je commencerais à 2 ou 5 mM, ça me semble le plus sur.

  6. #5
    mimosa

    Re : dégradation de protéine recombinante

    et concernant la purif par gel filtration je n'en ai jamais fait qu'est ce que tu utilises comme matériel chez qui tute fournis y a-t-il un kit qui marche mieux qu'un autre ou un super protocole?
    Merci d'avance

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Le fait de purifier rapidement la protéine sera peut-être suffisant pour se débarrasser des contaminants.

    Pour la gel-filtration, on a besoin de connaitre la masse de la protéine et des principaux contaminants pour savoir ce qui est le plus adapté.

    Quelque chose de possible aussi, c'est qu'une bonne partie des produits de dégradation soient instables en solution et qu'ils aient tendance à s'aggréger. Dans ce cas, si tu as accès à une ultracentrifugeuse, tu déposes ta protéine sur un coussin de sucrose 20%, tu centrifuges 1 heures à 100000 g, ta protéine reste au-dessus et les contaminants aggrégés vont traverser le coussin.

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  10. #7
    mimosa

    Re : dégradation de protéine recombinante

    ma prot à une MM de 98 kDa et les prot contaminante de 60 à 30 kDa. mais je vais également tenter le coussin de sucrose!

  11. #8
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    C'est un cas assez favorable. Une colonne S75 classique fera parfaitement l'affaire (sauf si ta protéine est une glycoprotéine !). Par contre, difficile de faire ce genre de manipe sur un coin de paillasse, c'est du matériel cher et fragile et je pense qu'il vaut mieux que tu le fasses au moins la première fois avec quelqu'un qui fait ce type de manipes.

    Si tu n'as pas accès à une FPLC ou HPLC, le mieux est de tenter une échangeuse d'ion. Vu la différence de taille entre ta protéine et les deux fragments, il y a de bonnes chances pour que leurs pI soient suffisamment éloignés pour que ça marche. Il existe des colonnes jetables en plastique (biorad), tu achetes de la resine (DEAE pour echangeuse d'anions, phosphocellulose pour echangeuse de cations) et tu peux faire des manipes pour des années.
    Je t'expliquerai plus tard le detail si tu es interessee, j'ai pas le temps tout de suite.

  12. #9
    ananda

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Mimosa : j'en ai déduis qu'il s'agit de formes de dégradation de la prot recombinante ou bien de prot contaminantes
    Pour s'en assurer, faudrait que tu compares sur un Coomassie les profils des puits vecteur recombinant/vecteur vide.

    a+

  13. #10
    mimosa

    Re : dégradation de protéine recombinante

    La seule chose que je peux dire c'est que lorsque je fais un immunoblot avec un anticorps anti-histidine je n'observe que ma protéine d'intérêt mais cela n'exclue pas que la protéine ait perdu son étiquette histidine lors de sa dégradation et que les bandes observées par coloration au nitrate d'argent ne soient pas ds formes de dégradation.

  14. #11
    mimosa

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Merci pour ces détails sur les colonnes j'en veux bien encore lorsque tu auras le temps car c'est un domaine que je ne maitrise pas du tout.

  15. #12
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Que tu fasses une gel-filtration ou une echangeuse d'anion (surtout dans le deuxième cas en fait), la premiere chose à faire en sortie de colonne de nickel est de dialyser (eventuellement par concentration/redilution) ta protéine contre une solution contenant très peu de sel. Si ta protéine ne s'aggrège pas dans un tampon A contenant 20 mM de tris et rien d'autre (ou de n'importe quoi d'autre pour stabiliser le pH), c'est l'ideal.

    Si tu fais une gel filtration, c'est simple, tu concentres ta protéine autant que tu peux (dans un volume inférieur à 100 µl de preference). Tu fais ensuite circuler dans la colonne ton tampon A, tu injectes la protéine et les protéines se séparent toutes seules en fonction de la taille (les plus grosses d'abord, les plus petites après), il n'y a plus qu'a recuperer les fractions et trouver dans lesquelles se trouve la protéine.

    Si tu fais une echangeuse d'ions, ça ressemble beaucoup plus dans le principe à une colonne de Ni. C'est un peu plus compliqué à mettre au point, mais ça sépare souvent plus efficacement quand on sait s'en servir. Dans ce cas, tu fais circuler le même tampon A avec la protéine. Celle-ci va s'accrocher (si tout se passe bien !) dans la colonne et ensuite tu vas laver abondamment au tampon A. Enfin, tu vas ajouter progressivement du NaCl jusqu'à ce que ta protéine se décroche. Sur FPLC, tu peux faire un gradient, c'est très simple, rapide et efficace. Sinon, il faut le faire "à la main", rajouter du sel par incrément de 50 mM jusqu'à ce que ta protéine se décroche.
    Suivant le pI de ta protéine, tu choisiras telle ou telle protéine. Si il est supérieur à 7, il faut une échangeuse de cation. Si il est inférieur à 7, une échangeuse d'anion. Plus ton pI est éloigné de 7, plus il faudra mettre de sel pour decrocher la protéine : 50 ou 100 mM suffiront peut-être pour une protéine de pI 6 ou 8, il faudra peut-être 300 ou 400 mM si le pI est 4 ou 10.


    Bon courage !

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  17. #13
    Svenn

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Si ta protéine est protéolysée, on s'attend à ce que l'extrémité His-tag soit la première à être coupée étant donné qu'elle est flexible. Donc tu ne peux pas savoir par un simple blot anti-His si il s'agit de fragments de ta protéine ou pas.
    Si tu veux vraiment le savoir, le mieux est de faire du sequencage N-terminal, mais c'est assez cher (50 euros l'acide aminé de memoire et il t'en faut 4 ou 5 pour etre sur).

  18. #14
    astrozygote

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Bonjour Mimosa.

    J'ai repris ton problème à la base, si par immuno-transfert tu n'as que ta protéine recombinante (100KDa), c'est que soit :
    - Les autres formes (à 60 et 30 KDa) ont été dégradées et ont l'étiquette poly-His (et elles l'ont perdue après).
    - Ces protéines ce sont fixées de façon non spécifique sur la résine (par des domaines contenant naturellement quelques résidus "histidinyl").

    Le premier cas, les réponses précédentes l'ont bien traité (à noter que le PMSF est à préparer extemporanément car sa stabilité est mauvaise au regard de l'AEBSF).
    Si tu as un anticorps polyclonal ou monoclonal qui reconnait un domaine de la prot. tu peux aussi avancer dans ton équation.

    Dans le deuxième cas, tu pourrais essayer d'incuber ta résine (Ni-NTA) avec une concentration faible d'imidazole, ça diminue l'affinité non spécifique des protéines contenant des histidines (sans le tag.). Regarde dans les publis, ça se fait.

    Tu peux aussi faire un SDS-PAGE sur un extrait de résine incubée avec ton extraction protéique (sans laver), ça te dirais si les contaminants apparaissent au moment des lavages, à cause des protéases ou avant.

    Cordialement,
    astrozygote : éditeur bénévole de l'annuaire Internet Dmoz.

  19. #15
    gorben

    Re : dégradation de protéine recombinante

    Salut,

    Ta purif de proteine doit aussi etre faite dans une souche de coli deletée de ses proteases (genre BL21). A partir de la les degradations deviennent deja moins frequentes (tjs rajouter un peu d'inhibiteur pour les contaminations exterieures).

    Essayes aussi de deposer sur gel ton extrait brut, ton extrait elué aprés un lavage PBS, 2 lavages... etc
    Ca te donnera une idée de l'origine de tes bandes parasites.

    Derniere solution, si tu as accés à un SM, tu decoupes une de tes bandes parasite et tu la passes en spectro pour l'identifier (degradation ou contamination?)

    A+

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