co-culture les cellules vont-elles interagirent??

[invite4ff9937a]

Bonjour,

Nous aimerions mettre en place dans mon labo une expérience de co-culture de cellules.
Sur une mono-couche de cellules stromales adhérente et à 80% confluente (dans une plaque 6 puits) nous aimerions co-cultiver pendant 3 jours, des cellules B immatures appelé cellules transitionnelles.

Les cellules stomales au fond de la boite ont été transfecté de manière à ce qu'elles expriment en surface une molécules particulières qui est le ligand d'un récepteur exprimé à la surface des cellules transitionnelles.

Notre but est donc de faire interagir pendant ces 3 jours les cellules transitionelles et les cellules stomales au fond du puit.

Nous n'avons jamais fait de co-culture est nous avons décidé de manière empirique de cultiver le tout dans 3ml de milieu.

Cependant vous devez savoir qu'à l'inverse des cellules stromales les cellules B transitionnelles ne sont pas des cellules adhérentes et je me demande si elles vont allez se nicher sur ou entre les cellules stromales ou même si elle vont venir s'y reposer.
Moi j'ai peur qu'elles restent flottante dans le milieu sans jamais venir interagir avec la monocouche de cellules au fond du puit!

Si l'un d'entre vous, chères collègues , avez de l'expérience dans ce genre de culture ou d'expérience j'aimerai tout simplement savoir ce que vous en pensez ou si vous aviez des conseilles à me donner?

Mieux, si l'un d'entre vous fait de la coculture entre cellules adhérentes et non adhérentes comment fait-il en pratique pour faire interagir les cellules, si tant est qu'il veux qu'elles interagissent ??


J'ai pensé après coup à diminuer le volume du milieu de sorte qu'il soit le plus petit possible, à peine recouvrant les cellules pour forcer les transitionnelles à toucher les cellules stromales mais je me dis que pour 3 jours de culture sa sera peut-être limite pour la survie de ces cellules assez fragiles!!

J'attends avec impatience vos avis et réponses diverses...

Cordialement
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[invite71f23525]

S'il y a moyen de mettre un plateau rotatif dans l'incubateur, pourquoi ne pas essayer de mettre les co-cultures sur ce plateau réglé à faible rotation pour permettre un mouvement modéré du liquide?

Greg

[piwi]

Vous semblez avoir prévu un moyen d'adhérence. Pourquoi ne lui faites vous pas confience dans un premier temps? D'une manière général, même si les cellules ne se collent pas au parois, elles sédimentent. Elles devraient donc rencontrer les récepteurs ce qui provoquera l'adhésion.
Maintenant, une conflence à 80% n'a de sens que si vous avez pris en considération le temps de doublement. Si elles sont confluentes rapidement, vous risquez d'avoir une culture pourrie.

Cordialement,
piwi

[invite4ff9937a]

Je n'ai pas bien compris la remarque de LXR.
Moi je veux que sa reste le plus stable possible pour qu'effectivement comme le dit piwi les cellules sédimentent le plus vite possible et en grand nombre. Du coup si j'agite même lentement le milieu je ne favorise pas vraiment la sédimentation des cellules.

Par contre j'avais pensé à centrifuger légèrement la plaque 6 puits pour faire tomber les cellules transitionnelles au fond et favoriser la rencontre avec les cellules stromales. Cependant j'ai peur qu'au début et à la fin de la centrifugation mon milieu ne s'échappe des puits....Qu'en pensez-vous ?

Pour la confluence, je te rassure piwi j'y ai bien pensé et de toute façon mes cellules stromales ne poussent pas très vite (je ne sais pas pourquoi elles sont s'y malheureuses ) du coup en 3 jours elles ne pousse pas ou très peux.

Donc finalement la sédimentation oui je laisse faire les choses, c'est juste que je me demande si elles vont bien sédimenter, en combien de temps et est ce que sa sera suffisant etc.... D'ou ma question de savoir si des gens ont des truc" pour favoriser les co-cultures comme la mienne

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Oui mais en agitant, vous mettez en mouvement les cellules transitionnelles et ainsi augmenter statistiquement les chances de ligation

[piwi]

Franchement je n'en suis pas certain. La force de liaison entre la cellule et son récepteur est elle si forte que l'agitation ne va pas la rompre immédiatement?
Entre deux protéines isolée l'agitation est une bonne idée. Mais là on parle d'une cellule, c'est autrement plus lourd.

Cordialement,
piwi

[invite853321bf]

Certes mais il n'y aura pas une liaison entre chaque couple de cellules mais plusieurs, non?

[piwi]

Oui. Absolument.
Mais ça ne veut pas dire que les liaisons vont être suffisantes pour s'opposer à l'agitation.

Dans la vraie vie, vous avez des molécules qui freinent le mouvement des cellules (dans le flux sanguin par exemple) afin de ralonger le temps de contact et permettre justement l'établissement des liaisons spécifiques qui justement ne tiendraient pas le choc sans cela. Ces molécules existent elles sur les cellules en culture, surtout si on force la liaison en fesant exprimer à l'une d'entre elle un récepteur transgénique?
Pas certain. Moi je laisserai d'abord les cellules au calme pour voir si il n'y a pas un contact qui s'établi.

Maintenant, je ne dis pas que c'est idiot et que ca ne marcherait pas. Je dis simplement qu'en première intention, ce n'est pas ce que je ferai.

piwi

[invite853321bf]

C'est vrai que les deux méthode ont du pour. De plus, à un tel taux de confluence, il est vrai que les cellules auront quand même une forte probabilité de se lier entre elles, même sans agitation

[invite4ff9937a]

Bonjour

J'ai regardé la culture se matin, il semblerai que mes cellules se soit bien installées entre ou sur les cellules stromales, maintenant est ce qu'elle interagissent vraiment sa je le verrai samedi lors de l'analyse FACS.

Donc visiblement le décantage de cellules non adhérente semble suffire pour le contacte mais je ne sais pas si en agitant le milieu les cellules se remettrai en suspension. Faudrai tester......

[invite71f23525]

Lorsque j'ai vu "des cellules surnageantes qui doivent interagir avec cellules adhérentes", j'ai instinctivement pensé au rolling des leucocytes sur l'endothelium vasculaire. C'est pour cela que j'ai proposé une agitation modéré, pour reproduire en quelque sorte une dynamique telle que le flux sanguin...C'était juste une proposition instinctive.

Bonne chance pour la suite, et tiens nous au courant!

Greg