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bandes parasites aprés révélation western-blot



  1. #1
    jfsebastien

    bandes parasites aprés révélation western-blot

    bonjour,

    j'aimerais savoir si quelqu'un à l'habitude de réaliser des immunoprécipitations avec révélation de la protéine d'intérêt en western blot?
    mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.
    apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane? utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire?
    merci de me donner votre avis

    -----


  2. #2
    Flyingbike

    Re : bandes parasites aprés révélation western-blot

    quelques pistes :
    -augmenter la [lait]
    -essayer de bloquer en BSA et/ou lait
    -augmenter le volume des lavages
    -augmenter le nombre des lavages

    Il est aussi possible de mettre du lait dans la sauce de l'anticorps primaire et secondaire.

    Malheureusement un WB capricieux peut etre asssez compliqué a résoudre.

  3. #3
    Orohena

    Re : bandes parasites aprés révélation western-blot

    J'ai mis 3 mois a en avoir un propre...
    Vérifie ta solution de PBS.
    Sinon les solutions de Flyingbike sont bien aussi !
    Bon courage.

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