Culture cellulaire MDCK

[franckeeuuhh]

Bonsoir,

je suis actuellement en stage dans un laboratoire où je fais de la culture cellulaire. Nous tournons actuellement et depuis le début de mon stage sur l'HCT-8 et nous entamons une culture de MDCK.
Problème, les HCT-8 résistent à la trypsine bien au dessus des 10 minutes réglementaires sans souffrir plus que ça. Ce qui n'est visiblement pas le cas des MDCK !!!
Nous avons essayé avec les instructions qui donnaient du 25% de trypsine pendant 10 minutes. Au bout des 10 minutes toujours rien, aucunes cellules ne s'étaient dissociées en laissant 10 minutes de plus pas beaucoup plus de résultat. Donc nous avons appliqué un traitement similaire à celui des HCT-8 => trypsine pure
Résultat : MDCK mortes (aucune prolifération ni même de fixation dans la nouvelle boite de culture)

Nous sommes pratiquement sûr que c'est la trypsine pure qu'elles n'ont pas trop aimé.
Quelqu'un aurait-il une technique de dissociation des MDCK qui fonctionne ... peut être avec autre chose que de la trypsine (papaïne???) ou bien une concentration différente ou pendant un temps plus court

merci d'avance.
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[fabien.che]

Bonjour,

Avant de se focaliser sur la trypsine, et étant donné que vous utilisez un nouveau type cellulaire, êtes-vous sûr :

- d'avoir bloqué assez rapidement l'effet de la trypsine après décollement
- de ne pas avoir centrifugé trop fort
- d'avoir ré-ensemencé à une densité suffisante
- d'avoir ré-ensemencé sur le même plastique
- d'avoir le milieu adapté à la culture des cellules ?

Autre chose, pour avoir un effet maximal de la trypsine sur un temps court, pensez à bien rincer vos cellules avec du PBS avant de mettre l'enzyme.

[franckeeuuhh]

bonjour,

nous avons bien entendu vérifié tous ces paramètres.
Pour bloqué l'action de la trypsine j'utilise le FBS présent dans mon milieu de culture avant de faire ma dilution et de resuspendre dans du milieu.
Nous avons repiqué les cellules selon les conseils de l'ECACC et il en est de même pour le milieu de montage. Pour le plastique nous utilisons toujours les mêmes boites et si jamais c'était ce paramètre, elles ne se seraient pas développées une première fois.

Après toutes nos réflexions il ne reste plus que la trypsine. Je sais que certains types cellulaires ne supportent pas la trypsine (cellules de schawnn) ou qui la supporte mais à des durées très courtes ou des concentrations faible. Ce qui semble le cas pour les MDCK mais les concentrations indiquées par l'ECACC ne suffisent pas pour les dissocier et une concentration supérieure les fait visiblement mourrir ...

[invited0be9ad2]

Bonjour
je sasi que ton message date de plusieurs années et que je fais dsu hors sujet mais je dois faire un exposé sur la lignée HCT8 et je ne trouve aucun document en francais et l'anglais n'est pas ma spécialité.
peux tu m'aider

[A voir en vidéo sur Futura]

[franckeeuuhh]

salut,

je veux bien t'aider mais par contre il faut me dire ce que tu veux, parce que te parler des HCT-8 comme ça ça ne rime a rien.
Pose moi des questions et j'essayerai d'y répondre

à bientôt,

franck

[invited0be9ad2]

je me souviens que la prof nous a demandé de parler de la ou on la trouve, sa croissance, ses exigeance si elle en a,s, sa morphologie

[franckeeuuhh]

je veux bien t'aider mais là franchement toutes les informations dont tu as besoin sont disponibles sur le site de l'ECACC.
http://www.hpacultures.org.uk/produc...ction=ecacc_gc
la croissance dépend de ce que tu veux en faire. Je peux te dire qu'elles forment facilement du plurilayer ce qui fait que même après confluence tu peux toujours les avoir vivantes.
au niveau morphologique elles n'ont pas de morphologie particulière.
En temps que chercheur je pourrai te dire que tu les trouves dans mon -80°C lol mais le site de l'ECACC va te donner la provenance et tu peux toujours dire que ça peut venir de chez eux LOL
J'espère que ça a pu t'aider
Franck

[invited0be9ad2]

peux tu m'expliquer ceci:
Growth Mode:

Adherent



Subculture Routine:

Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:5 to 1:10 i.e. seeding at 1-2x10,000 cells/cm² using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% CO2; 37°C.



Culture Medium:

RPMI 1640 + 2mM Glutamine + 1mM Sodium Pyruvate (NaP) + 10% Horse Serum (HS) or 5% Horse Serum (HS) + 5% Foetal Bovine Serum (FBS).



Karyotype:

2n = 46, pseudodiploid



Products:

Carcinoembryonic antigen (CEA)

et le terme plurilayer que tu emplois

merci

[franckeeuuhh]

bonjour,

plusieurs réponses me viennent à l'esprit mais elles sont toutes conditionnées par ton âge et ton niveau d'étude...
Si tu m'éclaires là dessus je pourrai te donner la réponse là plus adéquat!!

cordialement,

Franck

[invited0be9ad2]

j'ai 32 ans et j'effectue un dut genie biologique option analyses biologique et biochimique en formation cotinue

[franckeeuuhh]

OK je vais t'expliquer!

Il y a 2 types de cellules, les cellules qui en poussant sont adhérentes (HCT-8, MDCK, Caco-2,...) et des cellules qui ne poussent qu'en solution, elles "nagent", vivent et se divisent dans le milieu de culture (c'est le cas des Leishmania, des LB...).

Pour les cellules adhérentes, en l'occurrence ici les HCT-8, il faut "passer" ou sub-cultiver les cellules avant qu'elles ne commencent à mourir.
Les cellules en cultures sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules immortalisées. Ce qui veut dire qu'elles se multiplieront temps qu'il y a assez de nutriment dans le milieu de culture. C'est pour cela que dans le cas des HCT-8, et de beaucoup d'autre cellules, on te conseil des les passer quand elles sont à 70-80% de confluence. Cela veut dire que 70 à 80% de ton support, dans le cas des cellules adhérentes, sera occupé par ton tapis de cellule.
ici le ratio 1:5 ou 1:10 t'indique la dilution qu'elles vont supporter lors du passage. En dessous de ce ratio il risque de ne pas avoir assez de cellule pour que la culture reparte. Ils t'indiquent aussi les conditions de culture, soit approx 1-2x10^3 cell/cm2 parce que tu peux les cultiver dans des flasques de 25cm2 ou de 75cm2 ou encore plus grande ou encore en plaques à puits. Dans ce cas tu les ensemence à cette concentration/cm2.

Ils t'indiquent aussi que tu peux utilise 0,25% de Trypsine (exopeptidase) ou un mélange trypsine/EDTA pour les détacher. Les cellules doivent être lavé du milieu de culture soit avec du milieu sans serum soit avec du PBS préalablement chauffé à 37°C. Les cellules avec la trypsine ou trypsine/EDTA doivent être incubées entre 1 à 10min, ça dépend du type cellulaire, pour les HCT-8 d'expérience tu peux laisser plus longtemps, dans l'étuve de culture donc à 5% CO2 et 37°C. Attention une incubation trop longue dans la trypsine n'est pas bonne car c'est une enzyme qui dégradent les protéines en générales donc les adhésines qui maintiennent les cellules sur le support mais aussi d'autres protéines. L'EDTA est un chélateur de Mg2+ et de Ca2+ qui se loge entre les protéines et qui peuvent empêcher la trypsine d'agir. Pour les HCT-8 Trypsine/EDTA ça fonctionne bien mais il y a un produit qui s'appel Accutase et ça ça change la vie quant tu bosses avec les HCT-8. C'est un extrait d'enzyme venant de crustacés... un truc comme ça. Ca fonctionne très très bien, pas plus de 5 min à 5% CO2 37°C.

Les cultures cellulaires sont souvent cultivées en une couche de cellule, beaucoup de cellule arrivées à confluence meurent, on dit qu'elles font du monolayer. D'autres cellules comme les HCT-8 poussent horizontalement mais aussi verticalement, donc elles font plusieurs couches, 2 au moins et je dirai au plus après il manque vraiment de nutriment dans le milieu.

Medium veut dire milieu, ils te donnent la composition du milieu de culture optimal.

Karyotype, c'est le nombre de chromosome. Ici 2n=46 pour des cellules humaines c'est très normal.

Ensuite quand ils parlent de production de carcinoembryonic antigen (CEA) c'est que ces cellules produisent cette protéine. Pour faire short, le CEA est une protéine de la famille des adhésines qui est normalement exprimée uniquement pendant la vie embryonnaire. Lors du processus de "cancérisation" il arrive très souvent que des protéines qui ne devraient plus être exprimées le redeviennent. Ils te le précisent car cela peut fausser l'étude qui tu veux mener. Cela peut aussi expliquer les problèmes que l'on peut rencontrer quand tu veux passer les cellules et que la trypsine ne fonctionne pas de façon optimale.

Voilà j'espère que j'ai répondu à toutes tes questions.
Si jamais tu veux d'autres précisions n'hésitent pas.
Bon par contre je n'ai pas de référence à te donner, c'est la base de la culture cellulaire. Et je ne suis pas certain que dire à ton prof que tes infos viennent d'ici soit une bonne référence. En même temps tout ce que j'ai dis est vrai lol
et petit conseil, mets toi à l'anglais, c'est la langue de travail en biologie et tous les papiers sont écris en anglais. De plus l'anglais scientifique c'est très facile, les mots sont les mêmes lol

bonne soirée,

Franck

[invited0be9ad2]

merci de tes réponses claires qui m'ont bien aidés
j'ai même compris ce que l'on avait fait en TP lol
tu veux pas dvenir prof par hasard?

[franckeeuuhh]

Si j'ai pu t'aider j'en suis heureux... Pardon pour les oublies de s sur certains mots lol j'aurai du relire mais c'était trop long!

En fait je suis thésard, tout ça c'est de la cuisine de base de la labo.
J'ai aussi des étudiants en master que je dirige, donc j'enseigne un peu les modestes connaissances que j'ai. Mais il y a de forte chance pour que j'ai a enseigner un peu a la fac.

Si tu as d'autres questions n'hésite pas a les poser, si je peux je répondrai.

Bon week end,

Franck

[invited0be9ad2]

modeste connaissance c'est vite dit lol moi j'en ai aucune la biologie cellulaire n'est vraiment pas mon amie lol
voici mon mail si tu veux continuer à discuter: nat059@hotmail.com