Bonjour,
J'aimerais savoir s'il existait un couple degradation tag/protéase spécifique utilisé pas mal chez E.coli par exemple. Il faudrait que la protéase ne dégrade aucune protéine de l'organisme, sauf celle marquée par le degradation tag.
Je sais que certains organismes utilisent des protéases de défense contre d'autres organismes, et y sont donc insensibles. Il faudrait un truc du genre. Des idées?
Renaud
De quel tag parlez vous?
Que voulez faire exactement? Si c'est pour éliminer le tag, plusieurs options existent déjà telles qu'intercaller un site de coupure pour une enzyme spécifique entre le tag et la protéine d'intérêt.
Par exemple, dans la série des pGEX (plasmide GST), les plasmides pGEX T introduisent le site de coupure par la thrombine, les plasmides pGEX X introduisent le site de coupure par le facteur Xa et les plasmides pGEX P introduisent un site de coupure par la protéase presission (ca doit être une enzyme propriétaire ça).
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Bonjour, merci =)
Je voudrais produire dans une bactérie ou une levure une protéine contenant un dégradation tag d'une part, et d'autre part une protéase (par exemple sous le contrôle du promoteur Xgal) qui permettrait de la dégrader, et ce avec le minimum d'interférences par rapports aux autres protéines de la bactérie/levure.
Je sais que chez E-coli, il existe un tag SsrA (11 a.a) qui est reconnu par des protéases comme ClpXP et ClpAP. Donc si je clone une protéine-SsrA et une de ces protéases dans une levure, est ce que cette protéase ne dégradera que ma protéine-SsrA? Je sais qu'on ne peut pas prédire la réponse à l'avance, il faudrait voir si une levure exprimant cette protéase est viable, mais vous voyez l'idée et ce que je veux faire...
Donc connaissez vous un autre couple "degradation tag"/protease d'un organisme donneur qui n'interfère pas avec les protéines d'un organisme receveur?
Merci
Renaud
UP? Pas plus d'idées?
Renaud
Salut,
Normalement un tag ssrA chez coli devrait marcher (enfin si j'en crois les publisque j'ai lu). Par mon experience, j'ai quand meme l'impression que la degradation est correcte mais surtout sur des proteines solubles, cytoplasmiques et non essentielles... J'avais fais des "ssrA-tag" sur des proteines essentielles, et ca ne degradait pas du tout. De la meme maniere des "DNA binding protein" ca ne marche pas non plus. Bref mon experience est plutot negative.Envoyé par wolfgangouille
Pour exprimer le systeme chez la levure, ca m'a l'air un peu chaud. Il te faut sspB (adaptateur) ainsi que clpP (protease). Il te faut aussi le tmRNA. Bref ca fait beaucoup de chose a exprimer correctement (puis surtout la surexpression d'une protease je suis pas sur que ce soit une bonne idee). En plus il me semble que le recrutement de sspB-clpP se fait via le tmRNA dans le ribosome. Les ribosomes etant differents je ne suis pas sur que ca marche.
Si tu veux la methode c'est ici. J'avais utilise DAS+4 comme tag.
A+
Merci, je pense qu'il est temps pour moi de détailler d'avantage mon projet.
Le but de cette partie du projet, c'est d'avoir une activité protéase sur demande dans un organisme. Je pensais faire une protéine de fusion avec une partie de la protéase fusionnée au phytochrome, et l'autre partie fusionnée à PIF3, une protéine qui se fixe au phytochrome une fois activé par la lumière rouge. Je compte utiliser des simulation de dynamique moléculaire pour prédire au mieux là où couper la protéase pour qu'elle redevienne fonctionnelle quand les deux parties sont rattachée par phytochrome/PIF3. Bref, ça c'est de la bio structurale, c'est pas vraiment le point ici. Le truc c'est que les Clp sont multimériques, et ça casse un peu le truc en rendant tout de suite les choses plus complexes, mais du coups je me demande s'il est possible de faire une protéine fusion avec ssbP coupée en deux et d'utiliser des tag ssrA mutés qui en gros ne peuvent pas être reconnu sans ssbP (c'est ce qu'ils ont fait dans ton lien je crois).
Du coups dans l'hôte on aurait ClpXP ou ClpAP produit constitutivement, mais incapable de reconnaitre le tag ssrA muté, les deux protéines fusion Phytochrome-ss/bP-PIF3, puis les protéines tagées. A la lumière rouge, ssbP est reconstituée et les protéines taggées sont détruite rapidement. Par contre là où je flippe c'est que ces protéines taggées c'est des activateur/represseur de gènes, donc oui ça va se lier à l'ADN =(
Faut aussi que je regarde plus en détail cet histoire de tmRNA.
Merci en tout cas, ça m'aide pas mal!
Renaud
Renaud
Juste une question, le tmRNA il sert juste à taguer les protéines in vivo, où il intervient aussi dans la reconnaissance du tag par la suite? Parce que si on veut juste taguer les protéines, du coups on a pas besoin de toute la machinerie de tagage, il suffit de faire des mutants avec une extrémité Cter taguée, non?
Renaud
Salut,
Oui le tmRNA sert a tagger in vivo. J'avais discute avec T. Baker et elle etait pas super sure que la degradation des proteines pre-taggee, etait totalement tmRNA independante. Bref il sert peut etre a rien, mais autant qu'il soit la
Pourquoi te compliquer a faire des fusions quand il suffit de controler l'expression de sspB? sspB s'exprime vite et tres bien avec le plasmide decrit dans le papier mol. cel.
Es tu sur que sspB est un monomere? De plus je ne crois pas que la degradation des tag ssrA se fasse via clpA ou clpX. En fait clpA et clpX sont les adaptateurs pour clpP (protease). Ils permettent de debusquer le substrat et de l'amener a clpP. Dans ton cas normalement sspB devrait jouer le role d'adaptateur (a verifier, j'en etais sur au moment d'ecrire le message, maintenant j'ai un doute).
A+
oups, desole j'ai dis une betise ! Il faut bien clpA ou clpX pour fonctionner avec clpP (clpP est la protease et clpA/x sont les adaptateurs/ATPase domain).
SspB est peut être un dimère, mais dans le papier que tu m'as filé, rien n'est mentionné même si le schéma le laisse vaguement sous entendre (on voit pas grand chose en fait).
En fait le but c'est d'avoir le minimum de temps de latence, je pourrais très bien faire un truc genre yeast 2 hybrides avec le phytochrome et PIF3, disons que c'est la solution de secours, mais je préfèrerais éviter.
Il faut que la dégradation soit immédiate et bien bourrine. Si ça t'intéresse je peux t'expliquer à quoi servirait cette protéase pour que tu puisse juger =)
Dans le papier, ils ne parlent pas du tmRNA, mais en fait peut être qu'il y est car ils bossent chez E.coli et ils utilisent les protéases natives de la cellules d'après moi...
Et par contre eux ils arrivent bien à dégrader la protéine Arc-DAS+4 même si ça se fixe à l'ADN
Renaud
Si tu regardes bien les western (fig.4, la fig.2 c'est in vitro), tu vois que Arc semble nettement plus difficile a degrader que titin. Il faut 15' pour degrader titin alors qu'il en faut 60 pour Arc (et le niveau de base de titin est bien plus eleve que celui de Arc). De plus, ils surexpriment Arc via un plasmide, ca ne m'etonnerais pas qu'ils surexpressent Arc au point de saturer le systeme et donc d'avoir pas mal d'Arc soluble et dans le cytoplasme. Du coup la degradation initiale est probablement juste la degradation de la proteine soluble. Quand j'avais parle de mon probleme avec T. Baker elle m'avait dit que c'etait interessant et qu'ils n'avaient pas d'experience sur la degradation d'une "strong DNA binding protein" (j'avais fait, entre autre, une fusionEt par contre eux ils arrivent bien à dégrader la protéine Arc-DAS+4 même si ça se fixe à l'ADN'-ssrA
)
PS : je veux bien que tu expliques ce que tu veux faire. J'etais moi aussi a la recherche d'une methode de degradation bourrin et immediate de ma proteine
Imagine deux opérons:
p0---SA0*---CA1---CR1*
p1---SA1*---CA0---CR0*
p0 et P1: promoteur 0 et 1
SA = self activator
CA = cross activator
CR = cross repressor
* degradation tag
Au départ on active l'opéron 0 qui s'auto-entretient et réprime l'opéron 1 (CR1 plus fort que CA1)
On éclaire avec du rouge, SspB devient fonctionnel, SA0* et CR1* sont dégradées, il ne reste que CA1. L'opéron 1 est donc activé et réprime l'opéron 0. Si on rééclaire, on repasse à l'opéron 0 à condition que CA1 ai disparu entre temps. C'est un bit de donnée en gros =)
On peut compliquer en rajoutant des bits mais tu vois le principe. Avec un seul signal (lumière rouge puis infrarouge) répété le bon nombre de fois, on pourrait contrôler l'état des bits dans une cellule, et donc leur faire faire des actions séquentielles (utile en bioproduction par exemple)
Tu pense que les levures c'est bof? Parce que c'est vrai que les tag DAS ont été testé que chez E.coli, aussi l'insertion de la voie métabolique de synthèse du chromophore de PhyB n'a été insérée avec succès que chez E.coli même si ya des essais chez la levure. Au pire on pourrait faire les deux en parallèle...mais ce sera plus cher T.T
T'en penses quoi toi?
Renaud
J'ai trouvé un truc du MIT, une équipe qui travaillait en collaboration avec Tania Baker justement (que le monde est petit) et apparemment, ça marchait bien pour eux :
"In principle, these systems allow specific proteins (even those that are essential) to be removed from the cell in a few minutes and permit studies of the resulting changes in cell physiology on much shorter time scales than are generally possible with other methods."
Ils ont réussi à dégrader une protéine nécessaire à la construction du ribosome, mais pas à son maintient.
Renaud
Salut, est ce que par hasard, tu sais s'ils ont essayé de supprimer la partie Cter de l'adaptateur SspB pour voir si on a ou pas de dégradation des protéines taguées DAS+4?
A priori la simple mutation de Leu 121 réduit beaucoup la fixation de SspB sur ClpXP. Du coups on pourrait activer à volonté l'adaptateur en reliant la partie Nterà PHYB et la partie Cter à PIF3. La partie qui reconnait SsrA s'associerait à la partie qui reconnait ClpX à la lumière rouge.
Ce serait parfait non?
Renaud
salut
juste pour revenir a une question sur sspB, c'est un monomere, mais il y a deux monomeres qui se fixent a des endroits différents au complexe avec le tmRNA et le ribosome.
YOyo
Toutes mes sources m'indiquent que SspB se dimérise. La partie C ter de SspB se fixe à la partie Nter de ClpX (en doigt de zinc). Le Ka est assez faible, mais quand SspB se dimérise, chacune des deux extrémités Cter se fixe à deux ClpX différents de l'hexamère ce qui augmente l'affinité de SspB pour ClpXP.
Quelles sont tes sources?
Renaud
Bonjour, j'ai RE une question à ce sujet, en espérant qu'un pro (surtout gorben vu qu'il connait le sujet) passe par là.
Est ce qu'il existe déjà un protocole pour mesurer l'activité protéasique in vitro de cette protéase (ClpXP/SspB) ?
En théorie si on met le tout en présence d'ATP et d'une protéine taggée genre GFP, ya pas moyen de faire quelquechose? Après je n'ai aucune idée du tampon, des conditions de purifs, de mesure, etc... Sinon on fera comme dans la publi de Baker =)
Merki
Renaud
Personne n'a d'idée? Bon ben on va devoir innover.
Renaud
Salut,
Generalement ce que les gens font c'est des western-blot a differents temps apres le debut de la reaction. Comme ils l'ont fait dans le papier de T. Baker. Pourquoi ne pas vouloir utiliser la meme technique?
GFP c'est pas une mauvaise idee, ca te permet de suivre en temps reel la reaction mais il faut faire attention a ne pas degrader ton fluorophore lors de tes lectures.
Eventuellement, tu peux tagger une enzyme du metabolisme dont un kit existe pour mesurer son activitee. En condition ou le substrat est saturant, si tu peux suivre une baisse de l'activite specifique de ton enzyme qui correspondra a une baisse de sa concentration...
A+
Voici le wiki de notre projet, nous partons bientôt le présenter au MIT. Merci pour votre aide !
http://2010.igem.org/Team:ESBS-Strasbourg
Renaud
