amplification: PCR vs plasmides

[AstroBax]

Question que je pense bien débile, mais je n'ai pas pour autant trouvé de réponses sur le forum...


Quels sont les différents avantages/inconvénients de la PCR et de l'amplification par culture d'E.Coli contenant un plasmide de notre fragment?
Dans notre expérience (expression d'amylase par des cellules mammifères qui ne l'expriment pas), on a récupéré le cDNA, amplifié par PCR, puis insérer dans des plasmides, inséré dans des E.Coli et amplifié. Pourquoi l'amplification pas PCR n'a pas suffit?

Merci bien
Astro
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[invite94612525]

Bonjour Astrobax,
N'y aurait t-il pas un promoteur dans ton plasmide ?
je demande ça parcequ'un cDNA tout seul ne va grand chose...

[piwi]

Lors de l'amplifiaction PCR vous ne savez pas vraiment ce que vous amplifiez. Toute Taq polymérase fait des erreurs.
Un des premiers intérêt du clonage est de permettre d'amplifier vos différents amplicons séparément (une colonie un amplicon). Le séquencage vous permettra de trouver les amplicons sans erreurs et de poursuivre sereinement.

Ensuite il y l'intérêt d'avoir amplifié votre fragment. Que voulez vous en faire?

Cordialement,
piwi

[AstroBax]

C'est dingue comme c'est logique quand on connaît la réponse... Par contre on se sent un peu con par après...


Merci bien en tout cas...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite12cad8f0]

Bonjour

Comme l'a précisé Piwi, une amplification par PCR est moins fidèle qu'une amplification par culture bactérienne, à moins d'utiliser des enzymes High Fidelity (Pfu, KOD, Herculase ...) qui généralement coûtent au final plus cher en amplification et séquençages que le matériel et le temps nécessaires pour faire une culture de bactéries et une prep de plasmide.

Pour compléter la réponse de Noun à ta question "Pourquoi l'amplification pas PCR n'a pas suffi ?", ton cDNA doit impérativement :
- être précédé d'un promoteur (CMV, RSV ou SV40 par exemple), qui permettra à la RNA Polymérase II de tes cellules de s'accrocher à ton cDNA pour initier sa transcription en mRNA
- être suivi d'un signal polyA (SV40, bGH ...) qui va permettre à la fois de stopper la transcription et de recruter une autre enzyme (la poly (A) polymérase ou PAP) qui va initier la polyadénylation du mRNA, dont le rôle est de protéger le mRNA contre la dégradation, de faciliter son transport nucléo-cytoplasmique, et d'aider au recrutement du ribosome pour permettre sa traduction en protéine (source : Wikipédia).

A ces éléments peuvent ensuite s'ajouter des éléments facultatifs : enhancers, introns ...
Un plasmide correctement choisi pourra apporter tous ces éléments à ton cDNA une fois celui-ci cloné.


Par ailleurs (que Piwi me corrige si je me trompe ), il me semble qu'un amplicon (linéaire) sera beaucoup moins facile à transfecter qu'un plasmide (circulaire).


Bien cdlmt