Amplification PCR

[invite899b80e1]

Bonjour à tous,
J'ai un problème avec un couple d'amorces que j'ai moi même dessiner. Il s'agit de primer dégénérer d'aux maximum de 3 bases sur 20, jusque la tout est normale. Ces primers sont issue d'une séquence consensus de 4 gènes présent chez dans 4 génomes bactérien. J'ai donc tester ces oligos sur l'ADNg de ces espèces séquencés et ce couple fonctionne très bien, je n'ai pas de bandes parasites. Néanmoins, j'ai également une amplifications sur mon témoin négatifs. Il ne s'agit pas du blanc sans ADNg hein , non il s'agit de l'ADNg d'une autre souche séquencée qui n'est pas supposer contenir ce gène dans son génome.

J'ai vérifier in silico en blastn et blastx et les amorces ne match nul part sur ce dernier!!! J'ai regarder alors si la bactérien disposait de plasmides mais ce n'est pas le cas, donc aucune chance de trouver le gène dessus... Bien que mes amorces soit dessiner sur la phase codante, j'ai tout de même tenter de regarder dans la séquence non codante, et la pareil, aucun match!

Vraiment, je ne comprend pas comment cela est possible d'obtenir un amplicon à la taille attendu (avec un signal légèrement plus faible que les témoins positif) en ayant aucune hybridation possible in silico !


Si quelque a une idée, je suis preneur!!!
Merci de votre aide !
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

J'ai vérifier in silico en blastn et blastx et les amorces ne match nul part sur ce dernier!!! [/I]

Qui est ce dernier? Le génome de la bactérie témoin ou le gène?

En dehors de ça, ce n'est pas la peine de se prendre autant la tête pour un témoin négatif (sauf s'il t'est demandé). Pour être sûr de la validité de ton amplification, tu peux réaliser une PCR emboîtée avec des amorces spécifiques de ton gène. Ainsi si c'est du non spé, tu n'auras aucune amplification sur le produit de la réaction de PCR précédente. Tu peux au final réaliser un séquençage de ton produit de PCR, là tu seras sûr de la validité de ton produit.

Greg

[invite899b80e1]

Bonjour et merci de ta réponse.

Pour mon imprécision concernant le génome et le gène, j'ai vérifier les deux. Le gène n'est pas présent dans le génome de la bactérie (témoin négatif). En revanche l'une des amorces s'hybride avec 16 base sur 20 (recherche par clustalW), l'autre ne s'hybride nul par sur le génome de la bactérie témoin négatif.

Malheureusement le témoin négatif est quand même important car je dois ensuite le tester en screening sur la collection bactérienne du laboratoire et donc s'il fonctionne sur le témoin négatife, je risque d'avoir beaucoup de faux positif.

Sinon, je ne comprend le terme PCR emboîté? désolé, mais cela ne me dit rien. S'agit-il de réaliser, tout simplement une PCR avec les même amorces sur mon produit PCR? Je pensait augmenter ma température de 3°C (je serait alors à 1°C du TM des primers), mais je doute que cela puisse changer quoi que ce soit. J'ai également penser à la solution de séquencer le fragment, mais sur le fond je trouve dommage de séquencer un fragment PCR en sachant que l'on dispose du génome complet.

PS: la souche qui me sert de témoin négatif à été fournit par ATCC, je ne pense qu'il se soit tromper quand même!


Cordialement, will

[LXR]

Malheureusement le témoin négatif est quand même important car je dois ensuite le tester en screening sur la collection bactérienne du laboratoire et donc s'il fonctionne sur le témoin négatife, je risque d'avoir beaucoup de faux positif.

D'accord je ne savais pas que c'était pour faire du screen de banque. Dans ton cas en effet tu ne peux pas t'en passer. Pourquoi ne pas essayer de screener avec d'autres amorces?

Sinon, je ne comprend le terme PCR emboîté? désolé, mais cela ne me dit rien. S'agit-il de réaliser, tout simplement une PCR avec les même amorces sur mon produit PCR?

La PCR emboîtée utilise comme matrice le produit d'une première PCR et des amorces hybridant en 3' des amorces utilisées pour la première PCR. Ainsi tu augmente la spécificité de l'amplification puisque tu forces le système d'amplification a être spécifique de ton gène. En effet, si la première PCR donne un produit non spécifique, avec la PCR emboîtée, il y a peu de chance pour qu'il y ait amplification du non spé.

J'ai également penser à la solution de séquencer le fragment, mais sur le fond je trouve dommage de séquencer un fragment PCR en sachant que l'on dispose du génome complet.

Au contraire, le séquençage te donne une information précise sur ce qui s'est déroulé pendant ta PCR. Tu pourras connaitre le pourcentage d'homologie entre l'amplicon du témoin négatif et ton gène d'intérêt ou du moins savoir à quelles séquences s'hybrident tes amorces, facilitant ainsi le design d'amorces plus spécifiques.

Tiens nous au courant.

Greg

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