Criblage de thermostabilité des protéines par fluorescence

[invite79917c5c]

Bonjour à tous !

Voilà j'ai effectué il ya quelques jours un criblage de thermostabilité des protéines par fluorescence d'une protéine qui m'interesse.

Le principe est le suivant :
Dans différents tampons (pH,concentration..) j'ai effectué un test de thermostabilité de la protéine. L'utilisation d'un agent fluorescent : le SYPRO orange permet de suivre la fluorescence.

Le SYPRO orange est une molécule qui se fixe sur les parties hydrophobes des protéines. Lorsque celle-ci se dénaturent, les zones hydrophobes sont exposées et le SYPRO peut se fixer.
Ainsi on obtient se genre de courbes en fonction de la température : https://www.imagif.cnrs.fr/uploads/p...0thermique.png


Ce que je ne comprends pas : pourquoi après avoir dépasser une certaine tempéature l'intensité de fluorescence se met à diminuer ? Pourtant la protéine devrait etre dénaturée complétement et exposer de plus en plus ses parties hydrophobes ?


Merci de votre attention !
-----

[invite2ac96057]

ce n'est pas un problème d'interférence avec le photon qui est émis?
si tu augmentes la température, tu augmentes l'énergie de ton milieu et tu favorises ainsi l'excitation de ton fluorochrome qui va se dissiper beaucoup plus rapidement.
La physique c'est pas mon truc mais j'avais eu le même problème avec une autre technique où je faisais varier la température et on m'avait expliqué quelque chose dans le genre ...

[invite79917c5c]

Merci de votre réponse !

Ca ne pourrait pas etre simplement du aux 'mouvements' qui sont plus importants à haute température et donc l'agent fluorescent aurait des difficultés à se fixer ? (je ne sais pas si je me fait bien comprendre )

Merci

[invite2ac96057]

je ne sais bien si j'ai bien compris la manip alors ... si tu augmentes progressivement la température (ce que j'ai compris ) le phénomène que j'ai expliqué est possible.
Mais par contre si tu mets tes échantillons directement à des températures élevées j'avoue que je sèche un peu, ton explication parait plausible mais il reste probable que l'énergie du milieu étant plus élevée, dissipe la fluorescence.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je ne pense pas que la température ait un effet sur la mobilité electronique et donc la fluorescence. L'explication de allan me parait plausible : diminution de la capacité d'interférence du sypro avec les protéines.

[Edelweiss68]

je ne pense pas que la température ait un effet sur la mobilité electronique et donc la fluorescence.

Bonsoir,

Apparemment si.

En libre accès: http://hal.archives-ouvertes.fr/docs...0_7_2_56_1.pdf

PS: bon j'avoue ça date un peu!

[invite853321bf]

C'est un phénomène qu'on observe en PCR Temps Réel Sybr Green. Pour vérifier la spécifité de l'amplification, on augmente graduellement la température tout en vérifiant la fluorescence. Quand on atteint le Tm, la fluorescence diminue d'un coup car le Sybr Green n'est fluorescent que quand il se trouve dans de l'ADN double brin.
Mais là où je voulais en venir, c'est qu'avant cela, on observe une diminution de la fluorescence qui est linéaire, et lié à l'augmentation de la température