Marqueurs CD et cell sorting

[invite563835f6]

J'ai un soucis quant à la conclusion d'une expérience d'un article de viro sur la Dengue (Nature 2008). Les auteurs étudient le pattern d'expression de CLEC5A, une protéine de surface qui interagirait avec la Dengue et contribuerait à la réaction inflammatoire. Pour identifier les cellules qui expriment CLEC5A, les auteurs font une sorte de cell sorting où ils utilisent un anticorps anti-CLEC5A. Ils montrent ainsi que les cellules CD14+ et CD66+ ainsi que les macrophages expriment CLEC5A (d'après la légende de la figure). Comment arrivent ils à conclure ce qui suit ?

" CLEC5A (was originally identified as a DAP12-associated molecule) expressed exclusively on monocytes and macrophages "

Je veux dire, comment à partir de l'expression des marqueurs CD14+ et CD66+ ils peuvent conclure qu'il s'agit de monocytes, alors même que sur une base de donnée qu'on peut retrouver sur le site suivant : http://www.ebioscience.com/ebioscien...mancdchart.htm il n'y a pas de nature cellulaire précise pour CD66+ en tout cas ?

Merci de votre aide!
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[LXR]

On identifie de nombreux types cellulaires grâce aux différents marqueurs de surface. Un seul marqueur sera présent sur plusieurs types cellulaires mais déjà deux marqueurs peuvent n'être présents ensemble que sur un type cellulaire. C'est visiblement le cas des monocytes pour CD66 et CD14.

[invite563835f6]

On identifie de nombreux types cellulaires grâce aux différents marqueurs de surface. Un seul marqueur sera présent sur plusieurs types cellulaires mais déjà deux marqueurs peuvent n'être présents ensemble que sur un type cellulaire. C'est visiblement le cas des monocytes pour CD66 et CD14.

Merci beaucoup pour ta réponse, cependant, il n est indiqué nul part que les cellules portaient à la fois CD66 et CD14... Je joins une copie de l'expérience avec la légende et le matériel et méthode.
De plus je ne comprends pas ce que signifie l'abscisse FL1-H ?


LEGENDE:
Expression patterns of DC-SIGN and CLEC5A in human PBMCs. Freshly isolated PBMCs were double stained with PE-conjugated antibodies to CD markers (BD PharMingen) and FITC-conjugated anti-DC-SIGN mAb (a) or FITC-conjugated anti-CLEC5A mAb (R&D Systems) (b). CD marker-positive cells were gated to determine the expression of DC-SIGN and CLEC5A (dashed lines). Shaded areas represent isotype controls.

MATERIEL ET METHODE:
Flow cytometry analysis. Human polymorphonuclear cells and PBMCs were isolated from the whole blood of healthy donors; macrophages and DCs were generated from CD141 monocytes as described above. To characterize the expression pattern of CLEC5A and DC-SIGN, cells were stained with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-CLEC5A mAb (clone 283834; R&D Systems) or FITC-conjugated anti-DC-SIGN mAb (BD Pharmingen) in conjunction with phycoerythrin (PE)-conjugated mAbs against CD3, CD19, CD56, CD14 or CD66 (BD Pharmingen). Results were compared with those obtained using isotype-matched controls (IgG2b for anti-CLEC5A mAb, IgG1 for anti- DC-SIGN; Sigma)


J'ai retiré dans la figure ce qui concernait DC-SIGN.

D'autre part, j'ai une figure de flow cytometry encore où les auteurs suivent l'expression de NS3 (non structural protein 3) du virus de la Dengue. En abscisse il y a la mention FSC-H et en ordonnée FL2-H.


Extrait du matériel et méthode (qui fait suite à ce qu'il ya écrit juste au dessus):
To detect intracellular DV antigens, infected cells were fixed with 1% (v/v) paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% (w/v) saponin, followed by staining with NS3 mAb or an isotype-matched control (mIgG1; Sigma). After incubation for 1 h, PE-conjugated goat F(ab)9 anti-mouse IgG secondary antibody was added to detect emitted fluorescence by FACSCalibur (Becton Dickinson) with CellQuest software (Becton Dickinson).

Enfin, je ne comprends pas à quoi sert l'emploi d'un isotype control ? en pratique, qu'est ce que c'est ?

merci beaucoup pour votre aide!

[LXR]

Cites la source de ton document pour que je puisses le valider s'il te plait.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite563835f6]

Cites la source de ton document pour que je puisses le valider s'il te plait.

CLEC5A is critical for dengue virus induced lethal disease
Chen et al
Nature, may 2008

Merci

[sansplomb]

Bonjour,

FL1-H c'est la dénomination pour le canal FITC. Le H veut dire que c'est la hauteur du signal qui est mesuré.
FL2-H c'est le canal de la phycoerythrin ou PE le H même combat que pour le FL1-H.
FSC-H c'est le foward scatter ou taille relative des cellules.
C'est une vieille notation sans intérêt, et qui veut rien dire.

cordialement

[invite563835f6]

Bonjour,

FL1-H c'est la dénomination pour le canal FITC. Le H veut dire que c'est la hauteur du signal qui est mesuré.
FL2-H c'est le canal de la phycoerythrin ou PE le H même combat que pour le FL1-H.
FSC-H c'est le foward scatter ou taille relative des cellules.
C'est une vieille notation sans intérêt, et qui veut rien dire.

cordialement

Merci beaucoup pour ton aide,

à bientôt !